淫羊藿苷聯(lián)合糖皮質(zhì)激素對(duì)EAE鼠發(fā)病的干預(yù)及HPA軸影響的研究.pdf

1、目的：
　　在前期研究的基礎(chǔ)上，以C57BL/6雌性小鼠作為構(gòu)建EAE模型，給予ICA和MP聯(lián)合治療，從臨床評(píng)分、免疫相關(guān)因子水平、有關(guān)受體蛋白水平、脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡水平及組織病理等方面觀察兩者聯(lián)合使用后對(duì)EAE的保護(hù)作用，初步探討其相互作用的機(jī)制及對(duì)HPA軸的影響。
　　方法：
　　1、構(gòu)建EAE模型
　　C57BL/6雌性小鼠構(gòu)建EAE模型。將鼠源MOG35-55多肽與等體積CFA混合制成抗原乳劑，皮內(nèi)注射于

2、小鼠脊柱兩旁（分四點(diǎn)，每個(gè)部位50μL），于免疫后第7d加強(qiáng)免疫1次（等劑量MOG及CFA）。在免疫后第0及第48h內(nèi)腹腔內(nèi)注射500ng百日咳毒素，免疫后每日進(jìn)行觀察，稱重及發(fā)病后的評(píng)分。
　　2、EAE模型鼠鑒定
　?、倥R床表現(xiàn)：對(duì)神經(jīng)損害表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分。于免疫第8天開始陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)出EAE癥狀，第13天達(dá)到高峰。
　　②脊髓組織病理：取腰膨大處脊髓組織于4％多聚甲醛液中固定24小時(shí)，自動(dòng)脫水機(jī)中脫水后石蠟包埋，切

3、片進(jìn)行HE染色及紗羅絡(luò)花青髓鞘染色。
　　3、EAE模型鼠分組及治療
　　將造模成功的EAE鼠隨機(jī)分為5組，分別為A組：大劑量ICA+MP組；B組：中劑量ICA+MP組；C組：小劑量ICA+MP組；D組：MP組；M組：模型對(duì)照組；N組：正常對(duì)照組。于免疫接種后第13天，小鼠發(fā)病達(dá)高峰時(shí)開始給藥，連續(xù)給藥5天后，于第18天處死、取材。
　　4、各組免疫相關(guān)因子檢查
　　各組血清、血漿因子檢測(cè)：眼眶取血，離心后取血清

4、檢測(cè)IL-17、CORT，取血漿檢測(cè)ACTH，嚴(yán)格按照IL-17 ELISA試劑盒、CORT、ACTH放免試劑盒進(jìn)行操作檢測(cè)各因子水平。
　　5、各組腦組織蛋白GR水平檢測(cè)
　　分別取各組小鼠大腦相同部位→加入含PMSF的組織裂解液研磨→離心取上清液→用BCA法測(cè)蛋白濃度→配平→取各組約40ug蛋白→上樣→電泳→轉(zhuǎn)膜→漂洗→封閉→孵一抗、二抗→顯影。
　　6、各組流式檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡
　　腹腔麻醉小鼠后，用剪取0

5、.5cm長(zhǎng)脊髓，以腰膨大處最佳，用PBS及無(wú)菌鑷及眼科剪將脊髓組織研碎，取渾濁液常溫離心兩次，棄上清，留白色沉淀，加入50-100ul冰PBS混懸細(xì)胞，于顯微鏡中觀察，估計(jì)數(shù)目為10000以上，于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)脊髓組織細(xì)胞的凋亡情況，整個(gè)操作均于無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　小鼠于免疫第8天開始發(fā)病，于免疫第13天，即發(fā)病高峰期給予不同劑量ICA及MP治療后，臨床表現(xiàn)、脊髓組織病理改變及細(xì)胞凋亡情況、外周血炎癥因子水平

6、、腦組織受體蛋白水平等結(jié)果如下：
　?、袤w重及臨床評(píng)分變化情況：A組EAE鼠經(jīng)治療后體重較治療前有明顯增加（P=0.0166,P＜0.05），臨床評(píng)分較療前下降（P=0.0258,P＜0.05）。其他組小鼠體重評(píng)分與治療前相比較，雖有所改善，且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?、贓AE鼠的血清炎癥因子IL-17明顯下降，A、B、C、D組分別與M組相比，P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且給予治療后A、B、C、D組炎癥因子水平較N組都減低，

7、P＜0.01，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中以A組炎癥因子水平下降最為明顯，與C、D組差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；血清CORT含量變化顯示：其中A組血清CORT含量較M組明顯下降（P＜0.0001），但與N組無(wú)明顯差異；C、D組血清CORT水平較M組也有明顯下降（P=0.0007，P=0.0053），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但均高于N組；但B組血清CORT水平較N組卻有明顯升高（P＜0.0001），但與M組相比無(wú)明顯差異；血漿ACTH含量變化情況： A、

8、C組較M、N組無(wú)明顯差異；B組較M、N組雖有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D組較M、N組明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　?、跡AE鼠腦組織有關(guān)受體蛋白表達(dá)影響的變化：A、B、C、D組GR蛋白表達(dá)與M組比較均有增加（P＜0.01），但與N組相比，A、C組較N組均明顯升高（P＜0.0001）；D組與N組比較卻有降低（P=0.0078）；B組與N組無(wú)明顯差異。
　?、芗顾杞M織細(xì)胞凋亡情況：與M組相比，A、B、C、D