腺病毒介導鈣調磷酸酶Aα基因過表達在缺血再灌注和腎上腺素能受體誘導的心肌凋亡中的機制研究.pdf

1、第一部分鈣調磷酸酶在缺氧/復氧和腎上腺素能受體介導的心肌細胞凋亡中的作用 目的研究鈣調磷酸酶(Calcineurin，CaN)在缺氧/復氧和腎上腺素能受體介導的心肌細胞凋亡中的作用。 方法體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，觀察單純缺氧24h/復氧4h(H/R)及異丙腎上腺素(Iso10μmol/L)+缺氧24h/復氧4h(Iso+H/R)共同作用下心肌細胞凋亡率的變化，以及相應的鈣調磷酸酶的表達。用DNALadder法及流式細胞儀D

2、NA含量測定法(PI標記)檢測心肌細胞凋亡，RT-PCR法檢測CaNmRNA的水平。 結果Iso(10μmol/L)可以增加缺氧24h/復氧4h誘導的心肌細胞凋亡率(10.763±1.554vs8.737±1.120，P＜0.05)，同時CaNmRNA水平隨之增加(0.689±0.035vs0.464±0.023，P＜0.01)，CaN抑制劑環(huán)孢菌素A(CsA)可降低Iso+H/R所誘導心肌細胞凋亡率(6.270±0.306vs

3、10.763±1.554，P＜0.01)。 結論β-腎上腺素能受體激動劑可促進H/R所誘導心肌細胞凋亡，并伴隨有CaN表達的增加；CaN抑制劑CsA可抑制二者共同作用所誘導心肌細胞凋亡，說明CaN參與了心肌細胞凋亡，有促細胞凋亡的作用。 第二部分大鼠鈣調磷酸酶Aα基因重組腺病毒載體的構建 目的構建大鼠鈣調磷酸酶(Calcineurin，CaN)Aα基因重組腺病毒載體(AdCnAα)。方法RT-PCR法擴增大鼠Cn

4、Aα基因(1.59kb)，克隆至T載體，酶切鑒定和DNA測序證實CnAα序列正確后，用內切酶將CnAα亞克隆進入穿梭質粒pShuttle2-IRES-EGFP，構建載體pShuttle2-CnAα-IRES-EGFP，再通過酶切位點將CnAα-IRES-EGFP基因表達盒與pAdeno-x腺病毒載體骨架連接，構建重組腺病毒載體，并轉染HEK293細胞，出現CPE后收集含病毒的上清，抽提病毒DNA進行PCR鑒定。 結果測序證實Cn

5、Aα基因正確克隆到T載體中，酶切鑒定證實CnAα-IRES-EGFP基因表達盒成功重組到腺病毒載體基因組E1缺失區(qū)，并在HEK293細胞中成功包裝出具有感染活性的重組腺病毒顆粒。 結論本實驗成功構建了以增強型綠色熒光蛋白(EnhancerGreenFluorescentProtein，EGFP)為報告基因的大鼠CnAα基因的重組腺病毒載體，并在HEK293細胞中成功包裝出重組腺病毒顆粒。 第三部分鈣調磷酸酶Aα基因過表達

6、在缺氧/復氧和腎上腺素能受體介導的心肌凋亡中的作用 目的研究腺病毒介導的鈣調磷酸酶Aα基因(AdCnAα)過表達對缺氧/復氧和腎上腺素能受體介導的心肌凋亡中的作用及p38MAPK的變化。 方法體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，分別給予Iso(10μmol/L)+缺氧24h/復氧4h(Iso+H/R)及感染重組腺病毒(AdCnAα)+Iso+H/R處理，觀察AdCnAα對Iso+H/R誘導的心肌細胞凋亡的影響。用DNALadder法及

7、流式細胞儀DNA含量測定法(PI標記)檢測心肌細胞凋亡，用RT-PCR法和Western-blot法分別檢測CaNmRNA及蛋白表達。用Western-blot法檢測腺病毒介導的鈣調磷酸酶Aα基因(AdCnAα)過表達后p-38、p-p38MAPK的變化。 結果心肌細胞感染CnAα重組腺病毒組(AdCnAα+Iso+H/R)的細胞凋亡率比未感染組(Iso+H/R)明顯增加(14.247±0.525vs10.763±1.554，P

8、＜0.01)，且均高于正常對照組；同時p-p38MAPK的表達也比正常對照組分別增加2.42±0.19倍和1.60±0.22倍(P＜0.01)；p38MAPK的表達在干預前后同正常對照組比較無差異性變化(P＞0.05)。 結論腺病毒介導的CnAα過表達可使Iso+H/R共同作用誘導的心肌細胞凋亡率增加，p38MAPK可能參與了CaN促進Iso+H/R誘導心肌細胞凋亡的信號轉導過程。 第四部分鈣調磷酸酶在離體大鼠缺血再灌注

9、及腎上腺素能受體介導心肌凋亡中的作用 目的研究鈣調磷酸酶(Calcineurin，CaN)在缺血再灌注及異丙腎上腺素致心肌凋亡時的作用。 方法采用Langendorff大鼠離體心臟灌流技術，制備不同時間缺血/再灌注(I/R)和/或不同劑量異丙基腎上腺素(Iso)所致心肌損傷模型，在此基礎上給予鈣調磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A(CsA)，觀察心肌細胞凋亡率的變化及鈣調磷酸酶(CaN)的表達，由原位末端標記法(TUNEL)確定心肌細

10、胞凋亡，流式細胞術檢測細胞凋亡率的變化，RT-PCR法檢測CaNmRNA水平。 結果單純Iso在一定劑量時可致心肌細胞凋亡，并可增加I/R所誘導的心肌細胞凋亡率，CaNmRNA水平隨之增加，CaN抑制劑環(huán)孢素A(CyclosporinA，CsA)可降低I/R和Iso共同作用所誘導的心肌細胞凋亡率。 結論異丙腎上腺素可促使I/R所誘導的心肌細胞凋亡，并且伴隨CaN表達的增加，CaN抑制劑CsA可降低I/R和Iso共同作用所

11、誘導的心肌細胞凋亡，說明CaN參與了心肌細胞凋亡，有促進細胞凋亡的作用。 第五部分β受體阻滯劑對鈣調磷酸酶及腺病毒介導鈣調磷酸酶Aα基因過表達的影響研究 目的研究不同選擇性的β-腎上腺素能受體阻滯劑對缺血/再灌注(I/R)或缺氧/復氧(H/R)及異丙腎上腺素(Iso)致心肌凋亡時心肌細胞凋亡率的影響及其對鈣調磷酸酶(CaN)的調節(jié)作用。 方法采用Langendorff大鼠離體心臟灌流技術制備I/R+Iso所致離體

12、心臟損傷模型；體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞的方法制備腺病毒介導的CnAα(AdCnAα)過表達后，再H/R+Iso作用致心肌細胞損傷模型。在損傷模型基礎上給予不同選擇性的β-腎上腺素能受體阻滯劑(阿替洛爾、卡維地洛)進行干預，觀察不同藥物對心肌細胞凋亡率及CaNmRNA表達的影響，用TUNEL或DNALadder法確定心肌細胞凋亡，流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率，RT-PCR法檢測CaNmRNA水平。 結果采用Langendorff大鼠離

13、體心臟灌流技術制備的I/R+Iso所致心肌損傷模型，經卡維地洛干預后，心肌細胞凋亡率和CaNmRNA水平與干預前比較均降低(P＜0.05)，二者變化趨勢呈正相關；經阿替洛爾干預后，心肌細胞凋亡率和CaNmRNA水平與干預前比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞法制備的感染CnAα重組腺病毒(AdCnAα)后H/R+Iso所致心肌細胞損傷模型，經阿替洛爾和卡維地洛干預后，心肌細胞凋亡率與干預前比較均降低，差異有顯著性意義(