地塞米松對哮喘小鼠肺組織中TWEAK及其受體Fn14表達的調節(jié)作用.pdf

1、背景：
　　 支氣管哮喘（簡稱哮喘）(bronchial asthma，asthma)是一種常見病、多發(fā)病，由多種細胞和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾患。慢性炎癥對氣道的持續(xù)性損傷和機體對損傷性刺激的修復性反應所引起的氣道組織結構重構，造成持續(xù)性氣流受限、肺功能下降、氣道高反應性，從而引起一系列哮喘的臨床癥狀。全球哮喘控制現(xiàn)狀仍然十分嚴峻，有調查報告說，迄今亞太地區(qū)哮喘病的控制率僅3％，歐洲也只有5％的患者可達到哮喘控制。哮喘未

2、控制會嚴重影響患者日常生活，并造成急性加重時醫(yī)療資源的占用，進而成為沉重的社會負擔。然而哮喘的發(fā)病機制仍不清楚，哮喘的防治仍是一大難題。因此探討哮喘的發(fā)病機制和尋找新的治療靶點成為一項至關重要的任務。
　　 近年來提出哮喘的本質是氣道慢性炎癥，氣道炎癥貫穿哮喘整個病程。氣道炎癥涉及到炎癥細胞、炎癥介質、細胞因子三者的相互作用。哮喘病人氣道內浸潤的炎癥細胞有淋巴細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞。研究證實哮喘發(fā)

3、病機制中的主要效應細胞是嗜酸性粒細胞(eosinophil，EOS)，在哮喘患者的誘導痰、支氣管肺泡灌洗液、外周血中有大量的活化的EOS聚集。EOS浸潤引起的氣道炎癥，主要與EOS活化和釋放的顆粒蛋白有關，如主要堿性蛋白(major basic protein，MBP)能誘導IL-5、組胺等炎性因子的釋放從而介導氣道炎癥。已經(jīng)證實參與哮喘發(fā)病過程的細胞因子有IL-5、IL-13、轉化生長因子β(Transforming growth f

4、actorbeta，TGF-β)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)。哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮重要角色的體細胞有氣道上皮、氣道平滑肌細胞、成纖維細胞，而細胞因子和炎癥介質作用這些體細胞引起氣道發(fā)生病理性改變，如氣道上皮屏障破壞、氣道重構、氣道反應性增高。
　　 有關研究數(shù)據(jù)顯示腫瘤壞死因子樣弱凋

5、亡誘導因子(tumor necrosisfactor-like weak inducer of apoptosis，TWEAK)通過與其受體成纖維細胞生長因子誘導早期反應蛋白14(fibroblast growth factor-inducibleimmediate-early response protein14，F(xiàn)N14)結合后發(fā)揮多種生物學效應，包括促進炎癥發(fā)生、血管生成、調節(jié)細胞生存、增殖、凋亡。TWEAK是TNF-α生長因子家

6、族中的一員，是一種Ⅱ型跨膜蛋白，能水解為長度為156個氨基酸的可溶性細胞因子發(fā)揮作用。而FN14是與TWEAK具有生物學親和力的受體，是一種Ⅰ型跨膜蛋白，包含一個富含半胱氨酸的胞外區(qū)和一個包含腫瘤壞死因子受體相關因子(tumor necrosis factor receptor-associated factor，TRAF)結合基序的短胞內區(qū)。而TWEAK/FN14的相互作用是通過與TRAF分子結合激活兩條NF-κ B信號通路:ⅠκBα

7、磷酸化和P100程序化。眾所周知NF-κ B是免疫和炎癥反應細胞內一個廣泛的快速反應轉錄因子，通過表達細胞因子、趨化因子、細胞粘附分子、生長因子和免疫受體，在免疫球蛋白介導的疾?。ㄈ缦┲邪l(fā)揮作用。TWEAK可以在多種組織和細胞上表達，高度表達在炎癥細胞，包括活化的T細胞、分葉核的白細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、NK細胞、B細胞;而FN14在正常條件下表達水平相對較低，有趣的是FN14在組織損傷與修復區(qū)域、慢性炎癥疾病高度表達，這也證實

8、了TWEAK/FN14協(xié)調急性炎癥中組織修復的生理性作用，而慢性炎癥疾病中發(fā)揮病理性作用。既往有報道指出，TWEAK/Fn14也參與了風濕性關節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化癥、腎臟損傷、中風、神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和變性、腫瘤、心功能衰竭的病理過程。TWEAK還可以作為一些疾病的治療效果和早期診斷的生物標記，比如腎臟損傷，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，動脈粥樣硬化。
　　 綜上，我們發(fā)現(xiàn)TWEAK/FN14相互作用可以調節(jié)一些組織的炎癥反應。國外研究

9、發(fā)現(xiàn)TWEAK/FN14相互作用能刺激人支氣管上皮細胞釋放IL-8，GM-CSF，加重氣道的炎癥，用抗FN14單抗能阻止這些炎癥因子的釋放。TWEAK通過激活NF-KB途徑，誘導人腎臟細胞表達多種炎癥調節(jié)因子，如MCP-1，IP-10，MIP-1a，ICAM-1，VCAM-1，并能刺激體外與體內腎臟細胞的增殖。通過免疫組化發(fā)現(xiàn)在炎癥性肺病患者肺組織和肺泡灌洗液中有TWEAK的表達，說明TWEAK/FN14的相互作用與肺部炎癥性疾病息息相

10、關，本研究主要探討TWEAK/FN14在哮喘病理生理過程的作用。
　　 目的：
　　 1、觀察TWEAK在哮喘小鼠肺組織中的表達及分布。
　　 2、觀察FN14在哮喘組小鼠肺組織中的表達及分布。
　　 3、探討地塞米松對哮喘小鼠肺組織中TWEAK表達的調節(jié)作用。
　　 4、探討地塞米松對哮喘小鼠肺組織中FN14表達的調節(jié)作用。
　　 材料和方法：
　　 1、雌性BALB/C SPF

11、級小鼠由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。
　　 2、哮喘小鼠模型構建及分組:SPF級雌性BALB/c小鼠36只隨機分為正常對照組、哮喘組和地塞米松治療組，每組12只。哮喘組于第1天和第14天腹腔及皮下注射OVA氫氧化鋁混懸液0.2mL[含OVA10μg，AL(OH)3100μ1]致敏，第21天開始霧化吸入50 g/L的OVA溶液激發(fā)30min，每周3次，連續(xù)8周;地塞米松治療組致敏同哮喘組，于第21 d開始霧化吸入50 g/LOV

12、A，激發(fā)前30 min腹腔注射地塞米松(10 mg/kg);正常對照組用生理鹽水代替OVA致敏和激發(fā)。
　　 3、TWEAK及其受體FN14在各組小鼠肺組織中mRNA表達:各組小鼠末次激發(fā)24h后，麻醉后結扎右側支氣管，左肺行肺泡灌洗，支氣管肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)收集離心后取上清，沉淀物涂片染色顯微鏡下行細胞分類計數(shù)。取右側肺組織提取RNA后逆轉錄為eDNA，采用逆轉錄

13、聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測TWEAK及FN14在各組小鼠肺組織中的表達。
　　 4、通過免疫組化檢測TWEAK及其受體FN14在各組小鼠肺組織中的蛋白表達及分布:各組小鼠左側肺組織石蠟包埋切片后，行HE染色及免疫組化檢測TWEAK及FN14。用ImagePro Plus6.0軟件對陽性區(qū)域的平均光密度值行圖像分析(平均光密度值=積分光密度值(IOD sum)/陽性區(qū)域總面積(area sum)。
　　 5、west

14、ern blot檢測各組肺組織中TWEAK及FN14蛋白的表達水平。各組小鼠肺組織提取組織蛋白后，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉膜、加抗體孵育、顯色后拍照，用Gel-Pro Analyzer4圖像軟件分析各條帶灰度值，測出目的蛋白的表達強度（相對灰度值=目的蛋白表達強度/內參表達強度）。
　　 6、采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行結果分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差((x)±s)表示。兩樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因

15、素方差分析(Oneway ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD法;若方差不齊，采用校正的F檢驗（Welch法），并選用Dunnet T3法。P＜0.05，p＜0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 1、用OVA激發(fā)后發(fā)現(xiàn)，哮喘組小鼠出現(xiàn)煩躁不安、喘息、呼吸急促、大小便失禁，對照組小鼠無異常，地塞米松組也出現(xiàn)哮喘組的癥狀，但癥狀較輕。
　　 2、HE染色結果，對照組氣管上皮完整，管腔正常，無支氣管痙攣、

16、支氣管狹窄，無炎癥細胞浸潤。哮喘組小鼠的支氣管狹窄，管腔內可見粘液栓，支氣管痙攣，粘膜下、肺泡間質中可見大量以EOS為主的炎癥細胞浸潤，血管周圍尤為顯著，氣道上皮細胞脫落。較哮喘組,地塞米松組支氣管粘膜上皮、管壁結構較完整，管腔有輕度破壞，以EOS浸潤為主的炎癥細胞明顯較少。
　　 3、肺泡灌洗液細胞分析結果顯示各組BALF中的細胞總數(shù)分別為:8.42±2.12，22.12±5.54，14.89±3.20，嗜酸性粒細胞數(shù)分別為:

17、0.03±0.02，4.88±1.24，1.06±0.32，淋巴細胞數(shù)分別為:0.34±0.11，1.75±0.40，0.94±0.33。由此可見，哮喘組、地塞米松組BALF的細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞均較對照組明顯增多（F=40.09，F(xiàn)=149.35，F(xiàn)=76.51，P值均小于0.01），地塞米松組較哮喘組細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞計數(shù)明顯減少（F=40.09，F(xiàn)=149.35，F(xiàn)=76.51，P值均小于0.01）。

18、r>　　 4、實時定量PCR示，各組TWEAK mRNA的表達量分別為:1.01±0.10，2.35±0.12，1.52±0.12，F(xiàn)N14 mRNA的表達量分別為:1.01±0.10，3.48±0.24，2.30±0.19。由此可以看出，哮喘組、地塞米松組小鼠肺組織中TWEAK及FN14mRNA的表達均較對照組顯著升高(F=417.03，F(xiàn)=523.16，P＜0.01)，而地塞米松組較哮喘組TWEAK及FN14mRNA的表達顯著降低

19、(F=417.03，F(xiàn)=523.16，P＜0.01)。
　　 5、免疫組化結果顯示，各組TWEAK蛋白的表達量分別為:0.14±0.19，0.47±0.23，0.26±0.24，F(xiàn)N14蛋白的表達量分別為:0.18±0.02，0.57±0.03，0.28±0.03。由此可以看出，哮喘組、地塞米松組TWEAK的蛋白表達量較對照組有明顯增加(F=672.14，P＜0.01)，主要表達在小鼠肺組織氣道上皮細胞、肺泡上皮細胞和炎癥細胞。

20、地塞米松組TWEAK的蛋白表達量較哮喘組有明顯減少(F=672.14，P＜0.01)。哮喘組、地塞米松組小鼠肺組織中Fn14蛋白的表達量較對照組明顯升高(F=676.33，P＜0.01)，主要在小鼠肺組織氣道上皮細胞、血管內皮、血管平滑肌表達，而地塞米松組FN14的蛋白表達量較哮喘組有明顯降低(F=676.33，P＜0.01)。
　　 6、Western blot顯示，各組的TWEAK/內參灰度比值分別為:0.22±0.06，0

21、.72±0.08，0.35±0.05; FN14/內參灰度比值分別為:0.42±0.06，1.09±0.15，0.62±0.09。哮喘組、地塞米松組TWEAK的蛋白表達量較對照組有明顯增加(F=145.91，P＜0.01)，地塞米松組TWEAK的蛋白表達量較哮喘組有明顯減少(F=145.91，P＜0.01)。哮喘組、地塞米松組小鼠肺組織中Fn14蛋白的表達量較對照組明顯升高(F=97.25，P＜0.01)，而地塞米松組FN14的蛋白表達