日本血吸蟲SIEA26-28kDa單鏈抗體與人白介素18融合蛋白質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、目的： 本研究旨在構(gòu)建日本血吸蟲未成熟蟲卵可溶性抗原26-28kDa單鏈抗體與人白介素18融合蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒，并通過大腸桿菌BL21菌株表達(dá)該融合蛋白，確定該融合蛋白的表達(dá)水平，探討利用單鏈抗體聯(lián)合白介素18進(jìn)行日本血吸蟲病靶向免疫治療的可能性。 方法： 以pET32a/SIEA26-28kDa-EGFP-scFv和pGEM-T-CMV/IL18質(zhì)粒為基礎(chǔ)，利用PCR技術(shù)從pGEM-T-CMV/IL18質(zhì)粒中擴(kuò)

2、增得到帶有特定酶切位點(diǎn)的IL-18全長基因片段，經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切該片段和pET32a/SIEA26-28kDa-EGFP-scFv質(zhì)粒，分離并純化相應(yīng)目的片段后，利用連接酶連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)固體LB細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)，挑取單克隆，純化質(zhì)粒、鑒定克隆，獲得pET32a/SIEA26-28kDa-IL18-scFv質(zhì)粒；將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至大腸桿菌BL21菌株，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白IL18-scFv，同時表達(dá)EGFP-scFv

3、融合蛋白，觀察該融合蛋白的表達(dá)水平；并用Western-blot鑒定該融合蛋白的表達(dá)。 結(jié)果： 1.經(jīng)酶切鑒定，原有保存的質(zhì)粒證實(shí)為pET32a/SIEA26-28kDa-EGFP-scFv； 2.經(jīng)PCR成功擴(kuò)增IL-18基因片段； 3.經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切，連接酶連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，鑒定克隆，獲得pET32a/SIEA26-28kDa-IL18-scFv質(zhì)粒； 4.經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色鑒定，在I