雄烯二酮衍生DSTD誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞自噬和減輕其耐藥性的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 DSTD對骨肉瘤細(xì)胞增殖、凋亡和M I F表達(dá)水平的影響
　　目的：
　　探討DSTD對骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2OS增殖、凋亡的影響及MIF表達(dá)水平的影響。
　　方法：
　　1.用含10％小牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MG-63和U2OS細(xì)胞，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　2.用MTT實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度DSTD

2、(0、1uM、10uM、50uM、100uM)分別處理細(xì)胞24h后，統(tǒng)計DSTD對細(xì)胞增殖和凋亡的影響及濃度依賴性。
　　3.100uM DSTD作用于MG-63和U2OS細(xì)胞24h后，用實(shí)時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測細(xì)胞內(nèi)MIF mRNA的含量的變化，用Western Blot法檢測細(xì)胞內(nèi)MIF蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1.DSTD能抑制MG-63和U2OS細(xì)胞的生長，且呈一定濃度依賴性，但與

3、對照組相比，差異無顯著統(tǒng)計學(xué)意義。100uM DSTD作用于MG-63和U2OS細(xì)胞24小時沒有明顯改變細(xì)胞的增殖活力和細(xì)胞的凋亡率。
　　2.Real-time PCR結(jié)果:100uM DSTD處理MG-63和U2OS細(xì)胞24h后可顯著降低MIF mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。
　　3.Western Blot結(jié)果:100uM DSTD處理MG-63和U2OS細(xì)胞24h后，MIF蛋白表達(dá)水平明顯降低。
　　結(jié)論：
　　D

4、STD沒有明顯影響人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2OS的增殖活性和凋亡水平，但明顯減少了人骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2OS的MIF表達(dá)水平。
　　第二部分 DSTD通過抑制MIF的表達(dá)誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞ROS介導(dǎo)的自噬的研究
　　目的：
　　通過研究DSTD作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2OS后檢測MIF和自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討DSTD誘導(dǎo)骨肉瘤自噬發(fā)生中的作用及分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)MG-63和

5、U2OS細(xì)胞株，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.100uM DSTD處理骨肉瘤細(xì)胞MG-63和U2OS24h后和MIF ShRNA處理細(xì)胞48h后，分離細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)蛋白，用Western Blot檢測MIF、Bcl-2、Bax、pERK、Cyto HMGB1、Nucleic HMGB1蛋白的表達(dá)水平。
　　3.100uM濃度的DSTD作用于MG-63細(xì)胞和U2OS細(xì)胞不同時間(0h、4h、8h、12h、24h、4

6、8h)后用Westren Blot檢測自噬相關(guān)基因LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平。
　　4.不同濃度DSTD(0uM，50uM、100uM)作用于骨肉瘤細(xì)胞U2OS和MG-6324h后用Western Blot檢測MIF、Bcl-2、Bax、pERK、HMGB1、LC3B-Ⅰ和LC3B-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平。
　　5.用100uM DSTD與15mM NAC單獨(dú)及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細(xì)胞不同時間后，分離細(xì)胞核

7、和細(xì)胞質(zhì)蛋白，用Western Blot檢測MIF、Bcl-2、Bax、pERK、PARP、c-PARP、LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ、Histone H3、Cyto HMGB1、NucleicHMGB1蛋白的表達(dá)水平。
　　6.MTT實(shí)驗(yàn)和LDH釋放實(shí)驗(yàn):用100uM DSTD與15mM NAC單獨(dú)及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細(xì)胞不同時間后，MTT法測定細(xì)胞增殖抑制率，LDH釋放實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞毒性。
　　7.Annexin

8、Ⅴ/PI(AnnexinⅤ-FITC)雙染法流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡率:選用100uM DSTD或15mM NAC單獨(dú)及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細(xì)胞不同時間后，用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)進(jìn)行檢測分析凋亡。
　　8.DCF-DA法測定活性氧自由基(Reactive oxygen species，ROS):選用100uM DSTD或15mM NAC單獨(dú)及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細(xì)胞不同時間后，ROS的產(chǎn)生

9、用氧化反應(yīng)敏感的熒光試劑DCF-DA檢測。
　　9.免疫熒光:選用100uM DSTD或15mM NAC單獨(dú)及聯(lián)合作用于MG-63和U2OS細(xì)胞不同時間后，細(xì)胞用含4％多聚甲醛的PBS溶液固定30分鐘，再用含0.2％ Triton x-100的PBS滲透15分鐘。隨后細(xì)胞用10％的正常山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，室溫放置1小時。
　　結(jié)果：
　　1.100uM DSTD和MIF shRNA均顯著地抑制了MIF的表達(dá)，

10、同時導(dǎo)致了Bcl-2的明顯減少和Bax的明顯增加（Bax/Bcl-2比值上調(diào)），抑制了ERK的磷酸化。胞核HMGB1的含量減少，而胞漿HMGB1含量增加。
　　2.當(dāng)用100uM DSTD作用于骨肉瘤細(xì)胞株24小時后，LC3B-Ⅰ明顯地發(fā)生了向LC3B-Ⅱ的轉(zhuǎn)化。LC3B-Ⅱ富集的量與DSTD作用時間呈正相關(guān)，這提示DSTD誘導(dǎo)的自噬呈現(xiàn)時間依賴性。
　　3.分別用不同濃度DSTD處理U2OS和MG-63細(xì)胞24h后，免疫蛋

11、白印跡表明，隨著DSTD濃度的增加，U2OS和MG-63細(xì)胞中MIF、Bcl-2、pERK、HMGB1的表達(dá)逐漸降低，而Bax的表達(dá)逐漸增加。隨著DSTD濃度的增加LC3B-Ⅱ富集量也逐漸增加。這提示DSTD誘導(dǎo)的自噬呈現(xiàn)濃度依賴性。
　　4.我們檢測了抗氧化劑NAC對DSTD誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的作用。Wetern blot結(jié)果顯示，NAC共刺激逆轉(zhuǎn)了DSTD誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，但DSTD誘導(dǎo)的PARP的富集和PARP的剪切激活（c-

12、PARP的形成）不能被NAC共刺激逆轉(zhuǎn)。
　　5.MTT結(jié)果顯示抗氧化劑NAC共刺激后細(xì)胞增殖明顯降低，LDH釋放實(shí)驗(yàn)顯示NAC共刺激后細(xì)胞毒性增加。
　　6.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，NAC共刺激促進(jìn)了細(xì)胞凋亡。
　　7.熒光素乙二脂染色法(DCF-DA)來追蹤人骨肉瘤細(xì)胞株中ROS的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ROS的產(chǎn)生量隨著DSTD作用時間的增加而增高，但卻能被NAC抑制。
　　8.免疫熒光檢測DSTD誘導(dǎo)的自噬，結(jié)果顯示

13、LC3的形成很明顯，且呈時間依賴性。NAC共刺激減輕了DSTD誘導(dǎo)的自噬。
　　9.3-MA能夠減少DSTD誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞U2OS和MG-63產(chǎn)生的LC3B-Ⅱ表達(dá)水平。3-MA引起的自噬抑制作用也抑制了細(xì)胞增殖，并且促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，這提示我們DSTD誘導(dǎo)的自噬確實(shí)能延緩細(xì)胞死亡。
　　結(jié)論：
　　DSTD可通過抑制MIF誘導(dǎo)U2OS和MG-63細(xì)胞發(fā)生自噬，且呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。DSTD誘導(dǎo)的自噬是ROS介導(dǎo)的，

14、并且自噬延緩了細(xì)胞死亡。
　　第三部分 DSTD對骨肉瘤細(xì)胞耐藥性的影響及機(jī)制
　　目的：
　　探討DSTD在骨肉瘤細(xì)胞化療藥物耐藥中的作用及其分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)MG-63和U2OS細(xì)胞株，取對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。
　　2.用0.5uM的阿霉素或50uM的順鉑在100uM的DSTD存在或不存在的情況下處理24h后在顯微鏡下觀察人骨肉瘤細(xì)胞U2OS和MG-63形態(tài)的改變。<

15、br>　　3.MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度化療藥物阿霉素或順鉑單獨(dú)及聯(lián)合DSTD對人骨肉瘤細(xì)胞增殖活性的影響。
　　4.細(xì)胞用0.5uM的Dox或50uM的Cis在100uM的DSTD存在或不存在的情況下共刺激MG-63和U2OS細(xì)胞24h。
　　5.MG-63和U2OS細(xì)胞轉(zhuǎn)染GV230-HMGB1質(zhì)粒DNA72h后，WesternBlot檢測HMGB1過表達(dá)對HMGB1、pERK、LC3和PARP蛋白表達(dá)的影響，LDH釋放實(shí)驗(yàn)

16、檢測HMGB1過表達(dá)對細(xì)胞凋亡的影響。
　　結(jié)果：
　　1.與對照組比較，DSTD導(dǎo)致細(xì)胞輕微的皺縮，而阿霉素和順鉑部分導(dǎo)致細(xì)胞皺縮。在DSTD和化療藥物阿霉素或順鉑一起聯(lián)合作用于人骨肉瘤細(xì)胞的時候，引起了大批的細(xì)胞死亡。
　　2.化療藥物阿霉素和順鉑以劑量依賴的方式減少了細(xì)胞增殖。DSTD與化療藥物阿霉素或順鉑聯(lián)合使用比化療藥物單獨(dú)使用導(dǎo)致細(xì)胞增殖減少更為明顯，DSTD一同作用提高了骨肉瘤細(xì)胞對阿霉素和順鉑的敏感性。

17、
　　3.Western blot結(jié)果顯示100uM的DSTD逆轉(zhuǎn)了Dox和Cis誘導(dǎo)的HMGB1蛋白表達(dá)水平升高。Real-time PCR結(jié)果顯示100uM的DSTD也減少了Dox和Cis誘導(dǎo)的HMGB1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平升高。
　　4.Western Blot檢測結(jié)果提示:在化療時，HMGB1的過表達(dá)阻斷了DSTD誘導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　5.LDH釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在化療時，HMGB1的過表達(dá)阻斷了DSTD誘導(dǎo)的細(xì)