溶血磷脂酸對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道離子轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC26A3表達(dá)的影響及機(jī)制分析.pdf

1、目的:腹瀉是潰瘍性結(jié)腸炎常見的臨床癥狀，其產(chǎn)生主要與水鹽（包括Cl-、HCO3-和Na+）分泌和吸收不平衡相關(guān)。SLC26A3是位于腸上皮細(xì)胞頂端膜的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與調(diào)控腸道Cl-、HCO3-和水的吸收與分泌。已有體外研究證實(shí)溶血磷脂酸（LPA）可提高SLC26A3的基因表達(dá)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，并可能成為治療炎癥性腹瀉的候選藥物，但是關(guān)于LPA在體內(nèi)是否能提高SLC26A3表達(dá)并改善炎癥性腹瀉癥狀尚無研究報(bào)道，本課題首先對(duì)此進(jìn)行觀察。既往

2、研究提示，LPA可以通過提高SLC26A3的啟動(dòng)子活性而上調(diào)SLC26A3的細(xì)胞膜表達(dá)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，但對(duì)LPA是否有助于提高SLC26A3細(xì)胞膜表達(dá)的穩(wěn)定性和持續(xù)性卻未見研究報(bào)道。鑒于SLC26A3的糖基化在腸道環(huán)境中對(duì)維持SLC26A3細(xì)胞膜表達(dá)的穩(wěn)定性具有重要意義和PDZ結(jié)構(gòu)蛋白NHERF4對(duì)SLC26A3黏膜表達(dá)持續(xù)性的影響，課題利用Caco2細(xì)胞觀察LPA對(duì)SLC26A3糖基化水平的影響和NHERF4對(duì)LPA促SLC26A3蛋

3、白細(xì)胞膜表達(dá)的影響，以期能進(jìn)一步了解LPA調(diào)控SLC26A3細(xì)胞膜表達(dá)的相關(guān)機(jī)制。
　　方法:利用4％葡聚糖硫酸鈉（DSS）構(gòu)建C57BL/6J小鼠急性結(jié)腸炎動(dòng)物模型，設(shè)立正常對(duì)照組，觀察小鼠的體質(zhì)量、腸道出血情況、糞便含水量、結(jié)腸大體組織炎癥損害和鏡下病理組織學(xué)表現(xiàn)，參考Butzner JD標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸損傷組織學(xué)大體評(píng)分，參考Sutherland LR標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)腸炎疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白免

4、疫印跡實(shí)驗(yàn)分析炎癥結(jié)腸的SLC26A3 mRNA水平和蛋白表達(dá)，評(píng)估該動(dòng)物模型應(yīng)用于觀察分析LPA對(duì)炎癥性腹瀉和離子轉(zhuǎn)運(yùn)體SLC26A3黏膜表達(dá)的影響的可行性。然后，對(duì)DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠給予LPA灌腸治療，設(shè)立正常小鼠組、模型組、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）灌腸處理組做為對(duì)照，觀察LPA對(duì)結(jié)腸炎小鼠炎癥性腹瀉相關(guān)指標(biāo)的影響，如體質(zhì)量的下降、DAI評(píng)分、稀便的程度和黏膜炎癥損傷程度，并觀察分析LPA對(duì)中遠(yuǎn)段炎癥結(jié)腸的SLC26A3 m

5、RNA水平和蛋白表達(dá)的影響，以評(píng)估LPA做為治療炎癥性腹瀉候選藥物的可能性。利用Caco2細(xì)胞，將LPA與Caco2細(xì)胞共孵育，以共孵育時(shí)間0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、18小時(shí)為觀察時(shí)間點(diǎn)，觀察LPA對(duì)SLC26A3的基因表達(dá)、總蛋白表達(dá)、糖基化蛋白表達(dá)的影響。利用胰蛋白酶對(duì)SLC26A3蛋白的降解作用，設(shè)立LPA處理Caco2細(xì)胞組和LPA空白Caco2細(xì)胞組，以細(xì)胞和胰酶共孵育時(shí)間0min、5min、10min、30min為觀察時(shí)間點(diǎn)

6、，觀察分析LPA對(duì)SLC26A3細(xì)胞膜表面表達(dá)穩(wěn)定性的影響。構(gòu)建NHERF4質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染Caco2細(xì)胞，設(shè)立轉(zhuǎn)染NHERF4質(zhì)粒的Caco2組（pIRES2-ZsGreen1-NHERF4-Caco2組，即NHERF4-Caco2組）、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Caco2組（pIRES2-ZsGreen1-NP-Caco2組，即NP-Caco2組）、LPA處理的轉(zhuǎn)染NHERF4質(zhì)粒的Caco2組（LPA+pIRES2-ZsGreen1-NHERF4-C

7、aco2組，即LPA+NHERF4-Caco2組）、LPA處理的轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的Caco2組（LPA+pIRES2-ZsGreen1-NP-Caco2組，即LPA+NP-Caco2組）、LPA處理的Caco2組（即LPA+Caco2組）和LPA空白Caco2組（即Caco2組），以LPA與Caco2細(xì)胞共孵育12小時(shí)為觀察時(shí)間點(diǎn)，分析Caco2細(xì)胞轉(zhuǎn)染NHERF4質(zhì)粒后，LPA對(duì)SLC26A3的細(xì)胞表達(dá)的影響是否發(fā)生改變，并觀察分析LPA對(duì)

8、NHERF4蛋白表達(dá)的影響，初步評(píng)價(jià)LPA、SLC26A3、NHERF4之間的相互作用關(guān)系。
　　結(jié)果:⒈在構(gòu)建DSS誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠急性結(jié)腸炎動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中，模型組小鼠表現(xiàn)出糞便含水量增加、血便、炎癥活動(dòng)指數(shù)DAI值迅速上升、體質(zhì)量明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，與對(duì)照組相比，模型組的結(jié)腸大體組織學(xué)炎癥評(píng)分升高（p<0.05），結(jié)腸明顯縮短（正常組vs.模型組：7.53±0.3cm vs.4.8±0.8cm， p<0.05），炎

9、癥結(jié)腸黏膜中SLC26A3 mRNA表達(dá)明顯下降（正常組vs.模型組：14.03±1.4vs.1.0，p=0.00），蛋白表達(dá)明顯下降。⒉在觀察LPA對(duì)結(jié)腸炎小鼠炎癥性腹瀉和對(duì)炎癥結(jié)腸段SLC26A3表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)中，所有飲用DSS的小鼠均表現(xiàn)出體質(zhì)量下降，PBS處理組（實(shí)驗(yàn)前vs.實(shí)驗(yàn)后：17.02±0.19g vs.14.46±0.97g，p=0.001）和模型對(duì)照組（實(shí)驗(yàn)前vs.實(shí)驗(yàn)后：16.90±0.49g vs.13.5±0.

10、90g，p=0.001）體質(zhì)量明顯下降，LPA處理組的體質(zhì)量下降趨勢(shì)明顯減緩（實(shí)驗(yàn)前vs.實(shí)驗(yàn)后：17.36±0.67g vs.16.05±0.92g，p=0.06）。LPA處理組的糞便含水量上升幅度（18.89±8.67％）較PBS處理組（29.48±6.71％）和模型對(duì)照組（28.97±6.95％）明顯減緩（p=0.049，p=0.041）。LPA處理組SLC26A3 mRNA（2.27±0.4）較模型對(duì)照組（1.0）明顯上升（p=

11、0.03），模型對(duì)照組和PBS處理組（1.41±0.45）SLC26A3 mRNA差異無顯著性（p=0.09）。LPA處理組、模型對(duì)照組、PBS處理組的SLC26A3蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組均降低，但LPA處理組SLC26A3蛋白表達(dá)較模型對(duì)照組和PBS處理組升高。⒊在觀察LPA對(duì)SLC26A3糖基化水平影響的實(shí)驗(yàn)中，LPA孵育12小時(shí)的Caco2細(xì)胞與LPA空白Caco2細(xì)胞相比，SLC26A3基因表達(dá)量增加1.67±0.03倍，蛋白

12、表達(dá)量亦增加（相對(duì)β-actin的表達(dá)量，0.92±0.10 vs.0.46±0.05，p<0.05），SLC26A3的細(xì)胞膜表達(dá)與細(xì)胞漿表達(dá)比增加（膜表達(dá)/漿表達(dá)：2.17±0.17 vs.1.72±0.12，p=0.023），提示LPA在提高Caco2細(xì)胞 SLC26A3總蛋白表達(dá)的同時(shí)，也有助于SLC26A3的細(xì)胞膜定位和表達(dá)。在觀察 LPA對(duì)SLC26A3蛋白抵抗胰酶降解的影響的實(shí)驗(yàn)中，LPA空白 Caco2細(xì)胞的細(xì)胞膜SLC2

13、6A3蛋白在與胰酶共孵育10min后明顯減少，而LPA孵育12小時(shí)的Caco2細(xì)胞的細(xì)胞膜SLC26A3蛋白在與胰酶共孵育后含量未出現(xiàn)明顯減少，提示LPA可提高細(xì)胞膜SLC26A3蛋白抵抗胰酶降解的能力。⒋在觀察LPA與NHERF4在SLC26A3表達(dá)中的相互作用的實(shí)驗(yàn)中，與LPA+NP-Caco2組相比，LPA+NHERF4-Caco2組SLC26A3蛋白表達(dá)量明顯減少（相對(duì)β-actin的表達(dá)量，0.27±0.042 vs.0.56

14、±0.022，p=0.003），提示NHERF4可弱化LPA的促SLC26A3蛋白表達(dá)作用。與NHERF4-Caco2組相比LPA+NHERF4-Caco2組NHERF4的蛋白表達(dá)量無明顯改變，提示LPA對(duì)NHERF4的蛋白表達(dá)無明顯影響。
　　結(jié)論：LPA可提高炎癥結(jié)腸黏膜的SLC26A3表達(dá)，并減輕DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎性腹瀉的嚴(yán)重程度，提示其可做為治療結(jié)腸炎相關(guān)性腹瀉的候選藥物。LPA在Caco2細(xì)胞可提高SLC26A3的蛋白表