PSMAe-p驅(qū)動(dòng)shRNA阻斷PCA-1表達(dá)對(duì)前列腺癌細(xì)胞作用的研究.pdf

1、第一部分靶向干擾PCA-1的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定
　　 目的:
　　 成功構(gòu)建前列腺特異膜抗原增強(qiáng)子/啟動(dòng)子(PSMAe/p)調(diào)控的靶向的shRNA重組質(zhì)粒PSMAe/p-shPCA-1。
　　 方法:人工合成針對(duì)PCA-1基因的shRNA對(duì)應(yīng)模版的DNA序列,將此序列定向克隆到含有BamH I、EcoR I雙酶切位點(diǎn)載體質(zhì)粒pSIREN-RetroQ-ZsGreen,然后再連接到含有Sal I、B

2、am H I雙酶切位點(diǎn)PSMA增強(qiáng)子/啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體(PSMAe/p)上。重組質(zhì)粒經(jīng)菌液PCR、限制性內(nèi)切酶酶切和測(cè)序進(jìn)行鑒定;
　　 結(jié)果:
　　 通過(guò)PCR,質(zhì)粒雙酶切電泳和靶向序列測(cè)序鑒定,人工合成的靶向干擾片段成功插入載體PSMAe/p上,重組質(zhì)粒載體雙酶切圖譜和靶向序列檢測(cè)結(jié)果符合預(yù)期結(jié)果。
　　 結(jié)論:
　　 成功構(gòu)建以前列腺特異性膜抗原增強(qiáng)子/啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的靶向干擾PCA-1的shRNA質(zhì)粒

3、表達(dá)載體PSMAe/p-shPCA-1。
　　 第二部分 PSMAe/p驅(qū)動(dòng)shRNA靶向PCA-1抑制PCa細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:觀察人前列腺癌抗原-1基因沉默后對(duì)不同前列腺癌細(xì)胞系的影響,探索人前列腺癌抗原-1基因與前列腺癌進(jìn)展、惡性增殖、轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)能力的關(guān)系。
　　 方法:
　　 首先用免疫組化方法檢測(cè)人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3中PCA-1表達(dá):通過(guò)脂質(zhì)體LipofectamineTM2

4、000介導(dǎo)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3細(xì)胞中。應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的遷移能力變化,MTT法檢測(cè)干擾后細(xì)胞體外增殖情況,同時(shí)通過(guò)Transwell細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾后細(xì)胞轉(zhuǎn)移浸潤(rùn)能力;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)PCA-1的變化。
　　 結(jié)果:
　　 人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP和PC-3中均有PCA-1蛋白表達(dá);干擾后LNCaP細(xì)胞的遷移能力明顯下降,體外增殖速率明顯下調(diào),浸潤(rùn)能力顯著減弱。