VR1-siRNA的制備及其對小鼠癌痛的鎮(zhèn)痛作用研究.pdf

1、目的：
　　 辣椒素受體(vanilloid receptor type1,VR1)是近年來被克隆的一疼痛感受器,其是否參與癌痛的發(fā)生機制,相關(guān)研究還很少。RNA干擾技術(shù)(RNAinterference,RNAi)是近幾年新興的基因阻斷技術(shù)。它通過外源性或內(nèi)源性雙鏈RNA觸發(fā)同源性mRNA的降解,可以特異性地沉默目的基因。本實驗首先采用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建靶向VR1受體siRNA,然后鞘內(nèi)注射入癌痛模型鼠,觀察其對脊髓背角VR1受

2、體mRNA的效應(yīng)及鎮(zhèn)痛作用,以期揭示VR1在癌痛發(fā)生機制中的作用。
　　 方法：
　　 1.根據(jù)siRNA設(shè)計原則,參照VR1受體mRNA的序列設(shè)計出兩個19個堿基的DNA靶區(qū)段。合成的發(fā)卡DNA,兩端連有BamHI和Xho I酶切位點,便于與pRNAT-U6.2/Lenti表達載體重組。發(fā)卡DNA經(jīng)退火、純化,克隆入siRNA表達載體,以通用引物pRNA-U6.2 Forward、pRNA-U6.2 Reverse進行

3、PCR擴增鑒定。最后進行慢病毒包裝及效價測定。
　　 2.觀察兩個構(gòu)建好的siRNA實際效應(yīng)。分別對3只健康的C57BL/6小鼠鞘內(nèi)給予10μl siRNA,同時設(shè)置陰性對照組,12h后取脊髓L4-L6段背角組織,用RT-PCR法驗證對VR1的沉默效果。
　　 3.建立癌痛模型及行為學(xué)測定。14只健康雄性C57BL/6J小鼠被隨機分成2組:tumor組(右后肢移植10μl含2×105個B16BL6細胞,n=7)和sham

4、組(僅注射10μl PBS(pH7.4),n=7)。兩組術(shù)前連續(xù)測量2天雙側(cè)后肢機械刺激和熱刺激足反射潛伏期；移植腫瘤細胞后第3天開始測量,連續(xù)測至第20日。
　　 4.觀察VR1-siRNA對癌痛小鼠的效應(yīng)。21只模型鼠被隨機分成3組:實驗組(9只給予10μl pRNAT-U6.2/Lenti-siRNA)、空載體組(9只給予10μlpRNAT-U6.2/Lenti-)和3只模型對照組。鞘內(nèi)注射后6h、12h、24h,檢測雙側(cè)

5、后肢對機械刺激和熱刺激縮足反射潛伏期。之后,分別取不同時間點的脊髓背角L4-L6段組織,用RT-PCR法檢測VR1受體mRNA變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.發(fā)卡DNA退火結(jié)果表明siRNA設(shè)計正確。篩選的陽性重組子經(jīng)測序鑒定證實,目的片段已插入pRNAT-U6.2/Lenti表達載體,經(jīng)慢病毒包裝后分別命名為siRNlA(1)、sirNA(2)。
　　 2.RT-PCR結(jié)果顯示,對健康小鼠分別給予siRNA

6、(1)、siRNA(2),后者作用更強；我們設(shè)計合成的siRNA具有靶向特異性。
　　 3.癌癥引起的機械痛覺過敏從移植腫瘤細胞后第6天開始顯現(xiàn)；熱痛覺過敏則是從移植腫瘤細胞后第7天開始顯現(xiàn),均持續(xù)至痛行為觀測結(jié)束,即移植移植腫瘤細胞后第20天。
　　 4.給予模型鼠siRNA(2)6h、12h后脊髓背角的VR1受體mRNA明顯降低,腫瘤引起的疼痛明顯緩解；24h后siRNA對VR1受體mRNA作用消失。