卡介苗HSP70基因轉(zhuǎn)染白血病細(xì)胞瘤苗制備及抗瘤機(jī)制的研究.pdf

1、摘要第一部分：卡介苗HSP70基因轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞瘤苗制備及抗瘤機(jī)制的研究目的構(gòu)建卡介苗熱休克蛋白70(BCGHSP70)的真核表達(dá)載體，通過(guò)基因轉(zhuǎn)染表達(dá)于急性早幼粒白血病細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞株(HL60)細(xì)胞表面，制備細(xì)胞膜表面修飾的瘤苗并研究其抗瘤作用和機(jī)制。方法(1)BCGHSP70基因重組載體構(gòu)建及序列測(cè)定：利用PCR方法從卡介菌基因組中擴(kuò)增出帶酶切位點(diǎn)的BCGHSP70基因，與真核質(zhì)粒表達(dá)載體pDisplay連接，構(gòu)建重組載體pDis

2、playHSP70并進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。(2)膜表面表達(dá)BCGHSP70的HL60細(xì)胞瘤苗的制備：利用脂質(zhì)體2000將重組載體pDisplayHSP70轉(zhuǎn)染HL60細(xì)胞，免疫熒光單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面修飾鑒定。(3)轉(zhuǎn)染后的HL60細(xì)胞抗原性檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)組分為3個(gè)亞組：l組：未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的HL60細(xì)胞組(HL60wt)；2組：轉(zhuǎn)染空載體pDisplay的HL一60細(xì)胞組(HL60一pDisplay)；3組：轉(zhuǎn)染重組載體pDisplayHSP

3、70的HL60細(xì)胞組(HL60HSP70)；收獲各組HL60細(xì)胞，絲裂霉素C滅活后與同種異體外周血T淋巴細(xì)胞按照1：10比例混合培養(yǎng)72h，CFSE標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，EHSA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFN丫水平；絲裂霉素c滅活后的HL60細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞按照1：10比例混合培養(yǎng)48h后，加入野生型HL60細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞分別為10：1，20：1，40：1，80：1)共培育12h，LDH釋放改良法檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(C

4、TL)的殺傷活性。結(jié)果(1)PCR擴(kuò)增獲得的BCGHSP70基因大小與GeneBank公布的結(jié)核桿菌HSP70基因一致。酶切電泳和DNA測(cè)序證實(shí)重組載體pDisplayHSP70構(gòu)建正確。(2)共聚焦顯微鏡觀察檢測(cè)證實(shí)BCGHSP70表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的HL一60細(xì)胞表面。(3)轉(zhuǎn)染后的HL60細(xì)胞免疫原性檢測(cè)結(jié)果：①異體淋巴細(xì)胞增殖數(shù)：與實(shí)驗(yàn)HL60wt組、HL60pDisplay組比較，HL60一HSP70組能明顯促進(jìn)異體T細(xì)胞擴(kuò)增(p0

5、05)。②細(xì)胞因子水平：HL60一wt組、HL60pDisplay組、HL60HSP70組IFN吖含量分別為(10023士355)pg／ml，(10268323)pg／ml，(14601298)pg／ma。HL60一HSP70組明顯高于HL60wt第二部分：卡介苗HSP70基因轉(zhuǎn)染新鮮白血病細(xì)胞瘤苗制備及抗瘤機(jī)制的研究目的體外培養(yǎng)自血病細(xì)胞，并制備膜表面表達(dá)卡介苗熱休克蛋白70(BCGHSP70)的瘤苗，以進(jìn)一步研究其抗瘤作用和機(jī)制。方

6、法(1)新鮮白血病細(xì)胞的體外培養(yǎng)及其鑒定：分離收集15例急性髓系白血病(AML)細(xì)胞，用含細(xì)胞因子(SCF、FL、IL3和IL6)的無(wú)血清培養(yǎng)液Stemspall⑧體外培養(yǎng)，和15例B系急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞，含細(xì)胞因子(SCF、FL、IL3和IL7)的無(wú)血清IMDM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)，通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)、細(xì)胞化學(xué)染色和免疫表型測(cè)定驗(yàn)證所培養(yǎng)的白血病細(xì)胞。(2)膜表面表達(dá)BCGHSP70的白血病細(xì)胞瘤苗的制備：利用脂質(zhì)體2

7、000將重組載體pDisplayHSP70轉(zhuǎn)染到已被鑒定的白血病細(xì)胞，免疫熒光單克隆抗體進(jìn)行細(xì)胞表面修飾鑒定。(3)轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞免疫原性檢測(cè)：實(shí)驗(yàn)組分為3個(gè)亞組：1組：未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的自血病細(xì)胞組(wtLC)；2組：轉(zhuǎn)染空載體pDisplay的白血病細(xì)胞組(pDisplayLC)；3組：轉(zhuǎn)染重組載體pDisplayHSP70的白血病細(xì)胞組(HSP70LC)；收獲各組白血病細(xì)胞，絲裂霉素C滅活后與獲得完全緩解的急性白血病患兒自體骨髓T淋

8、巴細(xì)胞按1：10比例混合培養(yǎng)72h，CFSE標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IFNY水平；絲裂霉素C滅活后的各組白血病細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞按照1：10比例混合培養(yǎng)48h后，加入新鮮白血病細(xì)胞(效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞分別為10：1，20：1，40：1，80：1)共培育12h，LDH釋放改良法檢測(cè)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的殺傷活性。結(jié)果(1)短期培養(yǎng)的白血病細(xì)胞呈集落樣懸浮生長(zhǎng)，并保持增殖特性；在培養(yǎng)的110天，細(xì)胞

9、增殖較快，以后逐漸變慢。懸浮培養(yǎng)第10天收集細(xì)胞進(jìn)行免疫表型測(cè)定，15例AML細(xì)胞的CDl3、CD33表達(dá)，與培養(yǎng)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p005)；15例BALL細(xì)胞的CDl9、CDl0、CD22表達(dá)，與培養(yǎng)前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p005)。(2)共聚焦顯微鏡觀察檢測(cè)證實(shí)BCGHSP70表達(dá)在轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞表面。(3)轉(zhuǎn)染后的白血病細(xì)胞免疫原性檢測(cè)結(jié)果：①自體淋巴細(xì)胞增殖：實(shí)驗(yàn)wtLC組、pDisplayLC組、HSP70LC組