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文檔簡介
1、第一部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致比格犬肝急性炎癥伴腫瘤祖細胞形成
目的:明確馬兜鈴酸Ⅰ(Aristolochic acidⅠ,AAⅠ)致比格犬肝急性炎癥中,炎癥細胞因子白細胞介素-6(Interleukin6,IL-6)及炎癥信號通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子-3(Signaling transducer and activator of transcription-3,STAT3),轉(zhuǎn)錄因子核因子-κB(Transcription fac
2、tors nuclear factor-κB,NF-κB),探索急性炎癥環(huán)境下是否存在腫瘤祖細胞發(fā)生。
方法:健康成年比格犬8只,每組4只。實驗組口服3 mg/kg/day AAⅠ膠囊,對照組口服輔料膠囊;連續(xù)給藥至第10天,并于第12天處死。蘇木素-伊紅(Hematoxylin&eosin,H&E)染色評價肝臟損傷狀況并采用TUNEL染色檢測肝細胞凋亡情況。通過ELISA及RT-PCR分別檢測肝組織中IL-6釋放水平及基因表
3、達水平;采用免疫熒光,蛋白免疫印跡及免疫組織化學(xué)法檢測IL-6下游炎癥信號通路白細胞介素-6受體β(Interleukin6 receptorα,IL-6Rα)/Janus酪氨酸激酶2(Janus tyrosine kinases2,JAK2)/STAT3,激活蛋白1(Activator protein1,AP-1)/NF-κB炎癥通路及轉(zhuǎn)化生長因子-β(Transforming growth factorβ,TGF-β)通路激活情況;
4、通過免疫組化表型鑒定,蛋白檢測及蛋白免疫共沉淀法檢測肝前體細胞發(fā)生情況;采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光法鑒定腫瘤祖細胞標志。
結(jié)果:AAⅠ連續(xù)給藥10天,H&E染色組織切片顯示比格犬肝小葉紊亂,TUNEL免疫熒光染色呈現(xiàn)大量陽染細胞,提示肝細胞發(fā)生凋亡。肝組織中IL-6表達水平上調(diào),其下游通路IL-6Rα/JAK2/STAT3處于激活狀態(tài);同時炎癥相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB也處于激活狀態(tài),說明AAⅠ致比格犬肝損傷伴急性炎癥發(fā)生,其炎
5、癥主要由炎癥細胞因子IL-6及核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB介導(dǎo)。免疫組化,免疫印跡及蛋白質(zhì)免疫共沉淀法系統(tǒng)地評價了在炎癥環(huán)境下,肝組織出現(xiàn)八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(Octamer-binding transcription factor-4,Oct4),STAT3陽染肝前體細胞,并伴有TGF-β1信號通路激活,推測急性炎癥期TGF-β1通路激活有利于肝前體細胞增殖分化。通過組織免疫熒光染色法確定了表型為Oct4陽性,STAT3陽性,TGF-β1Ⅱ
6、型受體(TGF-β1 receptorⅡ,TBRⅡ)陰性,胚胎肝胞襯蛋白(Embryonic liver fodrin,ELF)陰性的腫瘤祖細胞,證實腫瘤祖細胞出現(xiàn)在AAⅠ引發(fā)的肝急性炎癥環(huán)境中。
結(jié)論:AAⅠ致比格犬肝急性損傷,可見肝細胞凋亡伴TGF-β1信號通路與IL-6/STAT3/NF-κB同時激活,出現(xiàn)“Oct4+,STAT3+伴TBRⅡ-,ELF-”特征的腫瘤祖細胞。
第二部分:馬兜鈴酸-Ⅰ致比格犬肝臟m
7、iRNome改變與腫瘤祖細胞形成的相關(guān)性
目的:探索AAⅠ致比格犬急性炎癥伴腫瘤祖細胞發(fā)生過程miRNAs表達譜,明確miRNAs靶向轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的分子事件。
方法:采用Exiqon miRCURY LNATM芯片平臺檢測犬類miRNAs表達譜,生物信息學(xué)預(yù)測,并通過qRT-PCR法驗證差異表達miRNAs(變化>1.5倍,P<0.05)。通過數(shù)據(jù)庫(www.targetscan.org),(www.mirbase.o
8、rg),(www.pubmed.com)推測miRNAs可能調(diào)控的靶基因,并通過蛋白免疫印跡法對其進行確認,采用激光共聚焦結(jié)合免疫熒光,檢測惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白促癌蛋白Myc(Oncogenic transcriptionfactor Myc,c-Myc)及癌胚RNA結(jié)合蛋白Lin28同源物B(Oncofetal RNA-bindingprotein Lin28 homolog B,Lin28B)表達情況。
結(jié)果: AAⅠ致肝組織
9、中73個miRNAs變化大于1.5倍,其中cfa-miR-200c,cfa-miR-34a,cfa-miR-378,cfa-miR-223,cfa-miR-24,cfa-let-7b變化>1.5倍,P<0.05。通過生物信息學(xué)預(yù)測,qRT-PCR驗證以上6個miRNAs及l(fā)et-7a-1~let-7b簇,miR-27a~miR-24簇成員let-7a-1及miR-27a表達水平均呈現(xiàn)出不同程度差異表達(變化>1.5倍,P<0.05)。通
10、過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析與預(yù)測,及蛋白免疫印跡驗證,證明了以上miRNAs調(diào)控的10個靶蛋白表達均發(fā)生了不同程度改變,其中7個蛋白變化>1.5倍,P<0.05。值得引起關(guān)注的是,磷酸化叉頭框O1(Phospho-forkhead box O1,p-FOXO1)表達增加22倍,同時伴有c-Myc和Lin28B,高表達,提示惡性轉(zhuǎn)化事件的發(fā)生可能與腫瘤祖細胞發(fā)生相關(guān)聯(lián)。
結(jié)論:AAⅠ致比格犬肝臟炎性惡變過程中,miRNAs呈現(xiàn)差異表
11、達譜,通過生物信息學(xué)預(yù)測和qRT-PCR驗證結(jié)果揭示miRNAs let-7a-1,let-7b,miR-27a,miR-223,miR-200c,miR-24,miR-34a,miR-378差異顯著,明顯受調(diào)控的靶蛋白是IL-6,NF-κB,Lin28B,c-Myc和p-FOXO1。
第三部分:Let-7b及miR-27a參與調(diào)控IL-6引發(fā)的HepG2細胞炎性惡變體外分子機制研究
目的:探索miRNAs let-
12、7b,miR-27a是否與炎癥細胞因子IL-6,核轉(zhuǎn)錄NF-κB及抗凋亡蛋白p-FOXO1存在相互聯(lián)系進而促進炎性惡變,明確上述分子所存在的饋路關(guān)系。
方法:將let-7b擬似物及抑制劑轉(zhuǎn)入人肝癌HepG2細胞,并外源性加入IL-6,觀察細胞增殖克隆情況;采用蛋白免疫印跡檢測Lin28B表達水平;采用免疫熒光法檢測STAT3及p-FOXO1在胞漿中共定位情況。在外源性加入IL-6條件下,分別檢測HepG2細胞轉(zhuǎn)入let-7b及
13、miR-27a擬似物或抑制劑后,分子通路p-STAT3,F(xiàn)OXO1,p-FOXO1,NF-κB(P50,P65)表達情況。
結(jié)果:軟瓊脂糖增殖克隆實驗結(jié)果顯示let-7b擬似物可抑制克隆形成,相反,let-7b抑制劑則促進克隆形成,IL-6具有促進克隆形成作用。蛋白免疫印跡系統(tǒng)闡明了IL-6可激活p-STAT3,并促使NF-κB上調(diào)。一方面,在IL-6/NF-κB聯(lián)合作用下Lin28B上調(diào),抑制let-7b,let-7b下調(diào)進
14、一步促進IL-6/NF-κB表達;另一方面,F(xiàn)OXO1受miR-27a調(diào)控。以上結(jié)果提示存在信號饋路IL-6/STAT3/NF-κB/Lin28B/let-7及IL-6/NF-κB/miR-27a/FOXO1與肝腫瘤祖細胞生成事件相關(guān)。
結(jié)論:AAⅠ致比格犬肝臟急性炎性惡變過程中,IL-6/STAT3/NF-κB/Lin28B/let-7b饋路耦聯(lián)IL-6/NF-κB/miR-27a/FOXO1與肝腫瘤祖細胞生成事件相關(guān)。Le
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