淡豆豉異黃酮提取物的分離、分析及其體內(nèi)代謝研究.pdf

1、淡豆豉(SemenSojaePraeparatum)為常用中藥，是中國(guó)藥典收載藥材，本品為豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的成熟種子和青蒿、桑葉等藥材發(fā)酵加工而成。具有解表除煩、宣發(fā)郁熱等功效，主要用于感冒、頭痛、煩躁胸悶、虛煩不眠等癥。本研究旨在建立淡豆豉中異黃酮的制備工藝以期得到高純度的異黃酮，并建立了相關(guān)指標(biāo)性成分快速、高效的分離純化方法；同時(shí)進(jìn)行了淡豆豉異黃酮提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究；對(duì)淡豆豉異黃酮提取物中活性成分

2、大豆素和染料木素進(jìn)行了初步的藥代動(dòng)力學(xué)研究。 一、淡豆豉異黃酮提取物的制備工藝 異黃酮(Isoflavones，ISO)是淡豆豉中的主要活性成分，它具有防癌抗癌、防治心血管疾病、治療婦女更年期綜合征等多種藥理作用，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。因此建立淡豆豉異黃酮提取物的制備工藝對(duì)開發(fā)利用淡豆豉藥材資源和開發(fā)現(xiàn)代中藥新藥等具有重大意義。實(shí)驗(yàn)用超臨界流體萃取工藝除去淡豆豉中油脂部位后，藥渣用75％乙醇提取，提取物濃縮成0.5g/ml

3、的樣品液，以AB-8大孔吸附樹脂為分離載體，分別用6倍樹脂體積的水洗脫，7倍樹脂體積的40％乙醇洗脫，和5倍樹脂體積的75％的乙醇洗脫，分別接收40％和75％的乙醇洗脫物，與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)照顯示40％的乙醇洗脫流分為結(jié)合型異黃酮：大豆苷、黃豆苷和染料木苷；75％的乙醇洗脫流分為游離型異黃酮：大豆素、黃豆素和染料木素。 二、淡豆豉異黃酮提取物指標(biāo)性成分的制備 本文采用反相高效液相色譜法(RPLC)和高速逆流色譜法(HSCCC)

4、分別對(duì)異黃酮中的活性單體化合物進(jìn)行了分離和制備。采用RPLC法分別制備了大豆苷、黃豆苷、染料木苷，大豆素、黃豆素和染料木素，制備采用的是YWGC18(20.0×250mmi.d.10μm)色譜柱，流動(dòng)相組成分別為不同配比的CH3CN-H2O-HAC(25∶75∶2，v/v/v)和(35∶65∶2，v/v/v)，流速為3.0ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)均為260nm，柱溫25℃。本文還采用HSCCC法制備了大豆素和染料木素，根據(jù)兩者的極性，

5、選擇了氯仿∶甲醇∶水(4∶3∶2，v/v/v)作為分離制備的兩相溶劑系統(tǒng)，流動(dòng)相流速選用2.0ml/min，主機(jī)轉(zhuǎn)速為800rpm，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm，在三小時(shí)內(nèi)制備得到兩種單體化合物。 三、淡豆豉異黃酮提取物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步制訂 在淡豆豉異黃酮提取物中，大豆素和染料木素是產(chǎn)生藥理活性的主要化合物，且在淡豆豉發(fā)酵過程中，大豆素和染料木素的含量有所提高，因此，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂是很有意義的。本研究中，根據(jù)《中國(guó)藥典

6、》所收載的方法，采用紫外分光光度法，以染料木素為對(duì)照品，建立了淡豆豉異黃酮提取物的含量分析方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=68.404C-0.0201，(r=0.9998)，線性范圍：2.4～12μg/ml；采用HPLC法建立了該提取物中大豆素和染料木素的含量分析方法，標(biāo)準(zhǔn)曲線為大豆素：A=54486C+44495(r=0.9998)，線性范圍2.4～12.0μg/ml；染料木素：A=76577C+39302(r=0.9997)，線性范圍2.0～1

7、0.0μg/ml。所建立的方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠。同時(shí)，對(duì)該提取物進(jìn)行了薄層鑒別實(shí)驗(yàn)及各種雜質(zhì)的限量檢查，對(duì)淡豆豉異黃酮提取物進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的初步制訂。 四、淡豆豉中活性單體化合物的體內(nèi)分析方法學(xué)研究及臨床前藥代動(dòng)力學(xué)初步探討 對(duì)大豆素和染料木素進(jìn)行臨床前藥代動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)，有利于人體藥代動(dòng)力學(xué)研究，并為開發(fā)異黃酮類保健品提供理論依據(jù)。本文首先建立了血漿樣品中大豆素和染料木素的分析方法，實(shí)驗(yàn)中采用液液萃取法對(duì)血漿樣品進(jìn)行預(yù)

8、處理，建立了以槲皮素為內(nèi)標(biāo)的反相高效液相色譜分離-紫外光譜檢測(cè)大鼠血漿中大豆素和染料木素的體內(nèi)分析方法。色譜分析采用Hypersil-ODS2(250×4.6mm，5μm)色譜柱，流動(dòng)相為CH3CN-H2O-HAC(33∶67∶1,v/v/v)，流速1.0ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260nm，柱溫25℃。采用本文建立的生物樣品預(yù)處理方法和反相高效液相色譜法分析測(cè)定生物樣品中兩者的含量，生物樣品預(yù)處理方法回收率高，色譜分離選擇性好。本方法

9、的準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度、定量線性范圍等均能達(dá)到體內(nèi)藥物分析的要求。 本實(shí)驗(yàn)將SD大鼠分組，分別給予兩個(gè)單體化合物和淡豆豉中游離型異黃酮提取物，采用口服給藥，于不同時(shí)間點(diǎn)取血，用上述建立的方法測(cè)定血漿中兩者的濃度，根據(jù)所得的血漿藥物濃度-時(shí)間曲線，采用非房室模型推算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，SD大鼠單劑量口服給予大豆素和染料木素，體內(nèi)血藥濃度吸收較快，消除較慢，兩者的達(dá)峰時(shí)間(Tmax)均約為0.33h，達(dá)峰濃度(Cmax)分別為0