脂肪干細(xì)胞促進(jìn)大鼠腹主動(dòng)脈瘤血管壁彈力板重建的研究.pdf

1、前言:
　　主動(dòng)脈瘤是一種威脅生命的疾病，患病率隨著社會(huì)老齡化逐漸增加?？煞譃樾刂鲃?dòng)脈瘤和腹主動(dòng)脈瘤。超出正常血管直徑50％以上的局限性腹主動(dòng)脈擴(kuò)張，稱為腹主動(dòng)脈瘤(Abdominal aortic aneurysm，AAA)。95％以上的AAA發(fā)生于腎動(dòng)脈以下。AAA的形成因素包含慢性炎癥，蛋白水解通路的反應(yīng)增強(qiáng)，氧化應(yīng)激及主動(dòng)脈壁中基質(zhì)的減少等。腹主動(dòng)脈壁由內(nèi)膜、中膜和外膜構(gòu)成，其中中膜占90％以上。中膜主要是由平滑肌細(xì)胞(S

2、mooth muscle cells，SMCs)及其分泌的彈性纖維構(gòu)成。對(duì)于直徑較大，破裂危險(xiǎn)系數(shù)很高的AAA，開放性的手術(shù)治療或血管內(nèi)的修補(bǔ)是目前被普遍認(rèn)可的治療方法。然而，絕大部分的AAA都是較小的，尚未達(dá)到手術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于早期較小的AAA選擇手術(shù)修補(bǔ)并無長期的存活優(yōu)勢(shì)，而手術(shù)危險(xiǎn)系數(shù)很高且不適合手術(shù)的患者也缺少更好的治療策略。因此，創(chuàng)新一種非手術(shù)的方法治療AAA勢(shì)在必行。隨著細(xì)胞和分子層面上對(duì)血管生物學(xué)及AAA形成機(jī)理認(rèn)識(shí)的深化，一

3、些藥物受體，例如他汀類、β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶阻滯劑、抗炎癥受體、抗生素等都有在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜕夏軌蚩刂艫AA的發(fā)展過程報(bào)道。雖然對(duì)一些受體進(jìn)行了臨床實(shí)驗(yàn)，然而，臨床試驗(yàn)效果欠佳，迄今為止，還沒有報(bào)道證實(shí)有哪種藥物能夠阻止AAA的發(fā)展。隨著干細(xì)胞治療的問世，提出了利用干細(xì)胞治療AAA的新設(shè)想。
　　脂肪干細(xì)胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是一種存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細(xì)胞。在皮下白色脂肪組

4、織中約占細(xì)胞總量的10％-20％，具有一般干細(xì)胞的特點(diǎn)，即自我更新和多向分化潛能。這種細(xì)胞群易于分離，與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)一樣，在特定條件下可分化為骨、軟骨、心肌細(xì)胞等?？梢酝ㄟ^脂肪抽吸術(shù)或脂肪切除術(shù)提取獲得，在體外培養(yǎng)中穩(wěn)定擴(kuò)增，不易衰老，免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示這種多能干細(xì)胞大多數(shù)來源于中胚層。ADSCs與BMSCs同屬于成體干細(xì)胞，但前者比后者更具優(yōu)勢(shì)。由于脂

5、肪組織分布廣泛，容易獲取，對(duì)病人創(chuàng)傷少，患者易于接受，細(xì)胞群易于分離，增殖速度快，因此具有很好的實(shí)驗(yàn)研究優(yōu)勢(shì)和臨床應(yīng)用前景。
　　ADSCs能夠促進(jìn)血管新生，從而改善局部缺血組織的血流。這一特點(diǎn)使得ADSCs在臨床治療上具有相當(dāng)廣闊的應(yīng)用前景。急性心肌梗死、缺血性心肌病、末梢血管疾病、急性腎小管壞死、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、缺血性腦病、外傷性脊髓損傷以及移植中發(fā)生的局部缺血都將有希望通過ADSCs進(jìn)行治療。盡管ADSCs促血管發(fā)生的機(jī)

6、制尚不清楚，但研究發(fā)現(xiàn)ADSCs能夠分泌大量血管生長因子。有報(bào)道指出ADSCs能夠抑制腫瘤壞死因子α，并且促進(jìn)抗炎細(xì)胞因子—白細(xì)胞介素10的分泌，表明ADSCs具有抗炎作用，能夠抑制炎癥。ADSCs已逐漸成為組織工程的種子細(xì)胞，并且在某些臨床腫瘤的靶向治療、某些缺血性疾病和代謝性疾病的治療中得到應(yīng)用，應(yīng)用前景廣闊。如今ADSCs已成為細(xì)胞、基因治療等研究的熱點(diǎn)。雖然已有報(bào)道指出利用BMSCs治療AAA，但迄今為止，國內(nèi)外尚未見到利用AD

7、SCs治療AAA的報(bào)道。
　　材料與方法:
　　1、SD大鼠ADSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　2、SD大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)與鑒定。
　　3、大鼠AAA模型制作。
　　4、共培養(yǎng)模型建立，共分3組:AAA主動(dòng)脈壁與ADSCs共培養(yǎng)組，AAA主動(dòng)脈壁與BMSCs共培養(yǎng)組，AAA主動(dòng)脈壁與培養(yǎng)液共培養(yǎng)組。
　　5、AAA主動(dòng)脈壁共培養(yǎng)7，14，21d后，用地衣紅染色法將動(dòng)脈壁中彈性蛋白染色。
　

8、　6、Westernblot法檢測(cè)AAA主動(dòng)脈壁中彈性蛋白的表達(dá)。
　　7、明膠酶譜分析檢測(cè)AAA主動(dòng)脈壁中MMPs的活性。
　　8、應(yīng)用AAA的主動(dòng)脈進(jìn)行血管SMCs的原代培養(yǎng)和免疫組織化學(xué)鑒定。
　　9、SMCs與ADSCs共培養(yǎng)，并用Real-timePCR檢測(cè)彈性蛋白與MMPs的基因表達(dá)。
　　10、ADSCs注射移植入動(dòng)物模型體內(nèi)，注射入PBS作為溶劑對(duì)照組，注射入生理鹽水作為空白對(duì)照組，培養(yǎng)4w，之后

9、手術(shù)取出腹主動(dòng)脈，做明膠酶譜分析，地衣紅染色及Western blot檢測(cè)。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1、ADSCs原代培養(yǎng)24h即可見細(xì)胞貼壁，3d后梭形細(xì)胞逐漸增多。約7d左右細(xì)胞融合約80％時(shí)進(jìn)行傳代。每5d傳代一次，傳至第3代后細(xì)胞形態(tài)較為均一，呈長梭形，排列緊密，類似成纖維細(xì)胞。用其進(jìn)行成脂誘導(dǎo)，第14d可見細(xì)胞中脂滴出現(xiàn)，折光性強(qiáng)，細(xì)胞核溶解消失。進(jìn)行油紅O染色可見大量紅色的脂滴。進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，28d可見結(jié)節(jié)狀細(xì)胞團(tuán)

10、，茜素紅染色可見紅黑色鈣結(jié)節(jié)。
　　2、BMSCs原代培養(yǎng)48h左右可見細(xì)胞貼壁，5d后梭形細(xì)胞逐漸增多，約10d左右細(xì)胞融合80％時(shí)進(jìn)行傳代。每7d傳代一次，傳至第3代后細(xì)胞形態(tài)較為均一，呈長梭形，排列緊密，類似成纖維細(xì)胞。成脂誘導(dǎo)，14d左右細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡狀脂滴，油紅O染色可見細(xì)胞內(nèi)的脂滴呈紅色。成骨誘導(dǎo)，28d左右出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)，茜素紅染色可見鈣結(jié)節(jié)被染成黑色，周圍呈紅色。
　　3、彈性蛋白的地衣紅染色:體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，

11、與ADSCs共培養(yǎng)的AAA主動(dòng)脈壁及與BMSCs共培養(yǎng)的AAA主動(dòng)脈壁，彈力板緊密排列，呈波浪狀，而對(duì)照組的AAA主動(dòng)脈壁，彈力板變直。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組AAA主動(dòng)脈壁染色后可觀察到彈力板呈波浪狀排列，而對(duì)照組中，AAA主動(dòng)脈壁染色后觀察到彈力板變直。
　　4、Western blot檢測(cè)彈性蛋白表達(dá):體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ADSCs及BMSCs共培養(yǎng)的AAA主動(dòng)脈壁，隨著時(shí)間的增加，彈性蛋白逐漸增多。對(duì)照組的AAA主動(dòng)脈

12、壁，彈性蛋白逐漸減少。動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的AAA主動(dòng)脈壁，相比較對(duì)照組的AAA主動(dòng)脈壁，彈性蛋白明顯增加。
　　5、明膠酶譜分析:體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組的AAA主動(dòng)脈壁，負(fù)染條帶的寬度隨時(shí)間的增長，逐漸降低至消失。對(duì)照組的AAA主動(dòng)脈壁，負(fù)染條帶逐漸明顯。體內(nèi)試驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組的AAA主動(dòng)脈壁，相比較對(duì)照組血管，負(fù)染條帶寬度明顯降低。
　　6、SMCs原代培養(yǎng):組織塊貼壁4h后，翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶。4d后，光鏡下可看到組織塊周圍有