膿毒癥中內(nèi)皮細胞損傷與器官損害及全身病情變化間關(guān)系的研究.pdf

1、現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展使許多以前難以開展的臨床高難診治技術(shù)得以實施，許多嚴重疾患病人因此得以存活，但危重病例比如膿毒癥(sepsis)的發(fā)病率也因此日漸增加。由于目前膿毒癥的治療措施尚無顯著進展，只有早期診斷、早期治療才有助于降低其死亡率。內(nèi)皮細胞既是膿毒癥中的效應(yīng)細胞和靶細胞，又在機體正常生理的維持中扮演著重要角色。因此，我們推測反映內(nèi)皮細胞損傷的指標能間接反映膿毒癥中組織的損傷和炎癥輕重程度。在檢測臨床常規(guī)臟器功能指標的基礎(chǔ)上，監(jiān)測內(nèi)皮

2、細胞狀態(tài)可望能更早、更敏感地判斷機體臟器綜合狀況。而目前已有的評價內(nèi)皮細胞損傷程度的指標都存在不同程度的不足之處。 目的： 本實驗擬通過在膿毒癥動物模型中檢測血液中循環(huán)內(nèi)皮細胞(circulatingendothelial cells，CECs)數(shù)量、內(nèi)皮細胞特異性基因mRNA含量和臟器血管通透性、組織含水量來綜合反映內(nèi)皮細胞損傷程度。同時觀察主要臟器組織學(xué)和功能的變化。分析內(nèi)皮細胞損傷與重要臟器功能間的關(guān)系。并在動物實

3、驗的基礎(chǔ)上，初步研究臨床膿毒癥患者內(nèi)皮細胞損傷與全身病情變化的關(guān)聯(lián)。 方法： 1、大鼠膿毒癥模型的制作及一般評價：90只大鼠分為6組，正常對照組，假手術(shù)(sham)組，盲腸結(jié)扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)3h組，CLP6h組，CLP12h組和CLP24h組，每組15只。CLP大鼠結(jié)扎盲腸全長，16號針頭穿孔3個；sham組僅做剖腹術(shù)。36只大鼠(每組6只)鼠尾采血計數(shù)術(shù)前、術(shù)后全

4、血白細胞數(shù)量；術(shù)后相應(yīng)時間點采集血清ELISA法檢測IL-6含量。 2、大鼠CLP后內(nèi)皮細胞損傷的檢測：36只大鼠(每組6只)CLP術(shù)后相應(yīng)時間點采血應(yīng)用密度梯度分離法分離、計數(shù)CECs。36只大鼠(每組6只)術(shù)后相應(yīng)時間點采血提取全血RNA，熒光實時定量PCR(real-time PCR)檢測內(nèi)皮細胞特異性基因tie2、vegfr2的mRNA含量。應(yīng)用伊文思蘭法和干濕比重法檢測18只(每組3只)大鼠心臟、肝臟、腎臟、回腸、肺臟

5、組織的血管通透性和組織含水量變化。 3、大鼠CLP后主要臟器功能變化的評價及其與內(nèi)皮細胞損傷的關(guān)聯(lián)分析：應(yīng)用全自動生化分析儀檢測36只大鼠(每組6只)K<'+>、Na<'+>、Cl<'->、AST、ALT、BUN和Cr的水平。同時HE染色觀察心臟、肝臟、腎臟、回腸、肺臟的病理組織學(xué)變化。比較血循環(huán)中tie2、vegfr2的mRNA含量與上述生化分析指標的相關(guān)性。 4、膿毒癥患者內(nèi)皮細胞損傷與病情變化的關(guān)聯(lián)分析：選擇重癥監(jiān)

6、護病房(intensivecare unit，ICU)的創(chuàng)傷患者，分為膿毒癥組和非膿毒癥組，在收入ICU的第1、3、7、14、21、28天采血提取全血RNA，real-time PCR檢測血循環(huán)中tie2的mRNA含量。同時應(yīng)用ELISA法檢測血漿vwF的含量。分別分析tie2 mRNA含量與APACHEⅡ評分、vwF含量的關(guān)系。同時檢測血白細胞總數(shù)、AST、ALT、BUN和Cr的水平，并將之與tie2 mRNA含量比較。 結(jié)果

7、： 1、大鼠膿毒癥模型的一般評價：大鼠CLP后24小時死亡率為31.82％(7/22)。正常對照和sham組的白細胞數(shù)量無顯著差異。CLP3h組白細胞數(shù)量顯著升高(P<0.05)，之后逐漸下降。與正常對照組比較，CLP組IL-6水平隨時間持續(xù)增長，但直到CLP后6h時IL一6增高幅度才具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，12h組、24h組IL-6水平進一步增加(P<0.01)。 2、CLP后內(nèi)皮細胞傷情的評價：與正常對照比較

8、，CEC數(shù)量在CLP后3h達到峰值(P<0.05)，隨后逐漸下降，CLP24h組CEC數(shù)量明顯低于3h、6h組(P<0.05)。CLP3h組循環(huán)血內(nèi)皮細胞特異性基因tie2 mRNA含量顯著高于正常對照和CLP其余時間點(P<0.05)，但vegfr2 mRNA水平在正常對照和CLP組間無顯著差異(P>0.05)。CLP后3h，大鼠心，肺的血管通透性明顯增加(P<0.05)，CLP后6h觀察到肝臟血管通透性的增加(P<0.05)。直到傷

9、后12h腎臟的血管通透性才發(fā)生顯著變化(P<0.05)。在傷后12到24h各臟器的血管通透性一直維持在較高水平(P<0.05)。CLP后3h，大鼠心、腎組織含水量增高(P<0.05)，12h時肝臟組織含水量上升(P<0.05)。 3、大鼠CLP后主要臟器功能變化的評價：CLP后肝細胞充血、變性。CLP后3h出現(xiàn)局灶性肺不張，肺泡內(nèi)紅細胞滲出，并且不斷加重。回腸黏膜充血、壞死、脫落。腎小球充血，小管內(nèi)可見脫落的上皮細胞。心肌可見局

10、灶性出血。與正常對照比較，AST、ALT和BUN分別在CLP6h和CLP12h出現(xiàn)顯著增加(P<0.05)。血清K<'+>、Na<'+>、Cl<'->在CLP后有不同程度的升高(P<0.05)。 4、膿毒癥患者內(nèi)皮細胞損傷程度與全身病情變化的關(guān)聯(lián)分析：膿毒癥組tie2mRNA含量顯著高于非膿毒癥組(p<0.01)。患者的APACHE Ⅱ評分與相應(yīng)時間點血循環(huán)中tie2 mRNA含量呈高度正相關(guān)(p<0.01)，Peason's相

11、關(guān)系數(shù)r=0.532(P<0.01)。其線形擬合方程為Y=12.66+4.922X(R<'2>=0.283)。血漿vwF含量在兩組患者間無顯著差異(P>0.05)，但與循環(huán)tie2 mRNA水平顯著正相關(guān)(P<0.05)，Peason's相關(guān)系數(shù)r=0.334.(p<0.05)。其線形擬合方程為Y=180.932+57.93X(R<'2>=0.112)。膿毒癥組全血白細胞總數(shù)顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)。膿毒癥組的BuN和cr值也

12、顯著高于非膿毒癥組(P<0.01)。AsT和ALT在兩組間均無顯著差異(P>0.05)。 結(jié)論：1、本試驗制作的CLP膿毒癥模型為后續(xù)的實驗提供了可靠的模型基礎(chǔ)。 2、CLP后內(nèi)皮細胞進行性損傷，表現(xiàn)為CECs數(shù)量和血液中tie2 mRNA含量增高，各主要臟器血管通透性增高，組織含水量增加。Real-time PCR檢測tie2 mRNA能靈敏反映內(nèi)皮細胞的損傷程度。 3、CLP后大鼠主要臟器組織學(xué)水平進行性損傷