豬Suv39h2、G9a和LSD1基因的分離、表達(dá)及功能研究.pdf

1、表觀遺傳學(xué)是研究表觀遺傳變異的遺傳學(xué)分支學(xué)科，它是指在不改變DNA序列的情況下，在堿基序列外的各種修飾和與之相關(guān)的各種蛋白質(zhì)或RNA的協(xié)同作用下，調(diào)控基因的表達(dá)，以完成生命周期或適應(yīng)環(huán)境變化，而且這套系統(tǒng)還能在世代之間傳遞。表觀遺傳學(xué)主要包括組蛋白密碼、DNA甲基化、RNA干涉、基因組印記等多個(gè)方面。作為組蛋白密碼之一的組蛋白甲基化，在基因表達(dá)調(diào)控、X染色體失活、基因組印跡、DNA修補(bǔ)中具有重要作用。目前關(guān)于豬表觀遺傳學(xué)的研究鮮有報(bào)道。

2、本論文選擇組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因Suv39h2、G9a，以及組蛋白去甲基化酶基因LSD1進(jìn)行研究，通過對(duì)其分離、克隆、表達(dá)譜分析、原核表達(dá)、多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)及其與性狀的關(guān)聯(lián)分析，為進(jìn)一步研究3個(gè)基因與豬生產(chǎn)發(fā)育、性狀形成或調(diào)控之間的關(guān)系打下基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下： 1.依據(jù)人Suv39h2、G9α和LSD1基因的mRNA序列，通過NCBI網(wǎng)站上Blast分析找出與人Suv39h2、G9a和LSD1基因同源的豬EST序列，構(gòu)建豬EST

3、重疊群并設(shè)計(jì)豬的特異引物克隆得到豬Suv39h2、G9a和LSD1(兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本)基因含編碼區(qū)全長(zhǎng)的cDNA序列，提交GenBank，登錄號(hào)分別為Eu219913、Eu219914、Eu219915(轉(zhuǎn)錄本1)和EU219916(轉(zhuǎn)錄本2)；采用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)基因的功能或性質(zhì)進(jìn)行了預(yù)測(cè)。 2.以梅山豬的心、肝、脾、肺、腎、子宮、卵巢、肌肉、脂肪、胃、小腸等組織為材料，利用半定量RT-PCR檢測(cè)了豬Suv39h2、G9α和LS

4、D1基因的組織表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因在上述11種組織中幾乎都表達(dá)，其中Suv39h2基因在肌肉、卵巢和脾臟中相對(duì)高表達(dá)；LSD1基因的兩種轉(zhuǎn)錄本同時(shí)表達(dá)，且在卵巢、腎臟和脾臟中相對(duì)高表達(dá)。 3.以出生后3d、35d、60d、120d和180d梅山豬肌肉組織為材料，利用半定量RT-PCR檢測(cè)了豬Suv39h2、G9a和LSD1基因在不同發(fā)育時(shí)期肌肉組織中的表達(dá)譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)是大致相同的，即均在生長(zhǎng)早期高表達(dá)，其中

5、G9α基因在35d時(shí)表達(dá)量是最高的，但Suv39h2和LSD1基因在3d時(shí)表達(dá)量是最高的，且LSD1基因的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本均同時(shí)表達(dá)。 4.構(gòu)建了豬Suv39h2、Gga基因重組原核表達(dá)載體pGEX-KG，利用SDS-PAGE及Westernblotting檢測(cè)出兩個(gè)重組原核表達(dá)載體均成功表達(dá)出了目的蛋白。 5.依據(jù)人G9a基因的cDNA和DNA信息，通過生物信息學(xué)及比較基因組學(xué)的策略，分離、克隆出豬G9aDNA序列，提交Ge

6、nBank(登錄號(hào)：EU709015)。在在大白豬和梅山豬中得到Gga基因的部分DNA序列，比對(duì)后發(fā)現(xiàn)了41個(gè)SNP，其中有32個(gè)為轉(zhuǎn)換(其中有18個(gè)C/T轉(zhuǎn)換)，7個(gè)為顛換，2個(gè)為插入/缺失突變。 6.應(yīng)用PCR-RFLP和PCR-PAGE分析技術(shù)，在分離的豬G9a基因第23、25內(nèi)含子以及3'UTR區(qū)各發(fā)現(xiàn)了一個(gè)堿基突變多態(tài)性位點(diǎn)。分析了三個(gè)位點(diǎn)在不同群體中的多態(tài)性，計(jì)算了三個(gè)位點(diǎn)的基因型和基因頻率，比較了各基因型在不同豬群

7、的分布差異。 7.以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)豬場(chǎng)2003、2004年屠宰的大白豬×梅山豬雜種豬F2代群體為試驗(yàn)豬群，對(duì)G9a基因中存在的SNP進(jìn)行了性狀關(guān)聯(lián)分析。初步分析該基因第23內(nèi)含子的堿基突變多態(tài)性位點(diǎn)與屠宰率存在顯著相關(guān)(p<0.05)，與皮率、骨率、肥肉率、瘦肥肉比率、至第一頸椎胴體長(zhǎng)、至第一肋胸胴體長(zhǎng)、肩部最厚處背膘厚、6-7肋骨處背膘厚、胸腰椎間背膘厚、臀部背膘厚、平均背膘厚存在極顯著相關(guān)(p<0.01)；初步分析該基因第