空氣源毒物對人正常肺上皮細(xì)胞的致突變效應(yīng)大鼠CTCF抑癌基因cDNA的分子克隆及其與致癌作用的研究.pdf

1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文空氣源毒物對人正常肺上皮細(xì)胞的致突變效應(yīng)大鼠CTCF抑癌基因cDNA的分子克隆及其與致癌作用的研究姓名：井立臣申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)指導(dǎo)教師：孫開來2000.4.1博^：學(xué)位論文物(Adducts)之間，與癌基因或抑癌基因突變譜和多態(tài)之間的聯(lián)系。原因在于這些參數(shù)與暴露之間的可能存在聯(lián)系。但這些研究均是以肺癌為研究對象，因受檢測手段的限制，一直未見有關(guān)研究正常組織中基因變化的報(bào)導(dǎo)。盡管許多研究者認(rèn)為正常

2、細(xì)胞(受致癌物作用induced／或通過自發(fā)的sporadic)獲得基因突變轉(zhuǎn)變成始動(dòng)細(xì)胞在人體器官內(nèi)可能是廣泛的，但因檢測手段的限制一直沒有直接的證據(jù)證實(shí)。為證實(shí)含有基因突變(癌基因／抑癌基因)的始動(dòng)細(xì)胞存在于正常人體內(nèi)，以及研究其與致癌物暴露之間的關(guān)系≯本研究以正常人肺支氣管上皮細(xì)胞為研究對象，研究了ki—ras基因12密碼子第2堿基G—T突變率及沿正常肺呼吸道(支氣管樹)的分布特點(diǎn)；并進(jìn)一步研究了其與空氣源毒物在肺內(nèi)的沉積，年齡及

3、吸煙狀態(tài)的關(guān)系。盡管推測致癌物暴露可增加基因突變率，但依據(jù)人體自發(fā)突變率資料，這一突變率仍然很低。因此，首先要求我們建立起一種高敏感度的突變檢測手段，定量檢測出在正常組織中可能存在的稀少突變。為實(shí)現(xiàn)這一目的，我們首先建立了一種高敏感度的ki—ras突變檢測技術(shù)(敏感度達(dá)106即在一百萬個(gè)正?；虮尘爸袡z測出10個(gè)以下的突變基因)。在這一方法中，我們在第一輪PCR中在引物近末端引入了一錯(cuò)配堿基，使其含半個(gè)BstNI酶切位點(diǎn)序列。這樣，野生

4、型擴(kuò)增子含BstNI酶切位點(diǎn)，而突變將破壞這個(gè)酶切位點(diǎn)。經(jīng)過BstNI酶切，野生型擴(kuò)增子不能作為第二輪PCR擴(kuò)正增的模板。在第二輪PCR中，我們應(yīng)用了套式等位特異PCR(NestedASPCR)，特異擴(kuò)增突變基因。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)過程，建立了最終PCR產(chǎn)物與初始突變模板拷貝數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)而用此標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析了取自不同支氣管段上皮細(xì)胞中的突變細(xì)胞數(shù)。我們將此方法命名為突變富積等位基因特異PCR(MutantsEnrichedAllel

5、eSpecificPCR)。此方法的最大優(yōu)點(diǎn)在于能夠在眾多的野生型基因背景中，特異、定量檢測突變的目的基因，因避免了其它方法中所利用的從膠中純化特異帶的步驟，減少了污染的機(jī)會(huì)，避免了假陽性。因引入AS—PCR，增加了特異性和定量的準(zhǔn)確性。結(jié)果表明在最終PCR產(chǎn)物中沒有任何非特異帶，特異帶的強(qiáng)度與初始突變模板拷貝數(shù)呈對數(shù)線性關(guān)系。用此方法我們可以從10微克基因組DNA中(wildtype)檢出5個(gè)以上的突變拷貝。這～方法可用于檢測在正常組