病毒及質(zhì)粒DNA刺激后小鼠肌細(xì)胞內(nèi)IFN-β與PD-31的表達(dá)情況.pdf

1、目的:自1798年發(fā)現(xiàn)天花疫苗以來，人類已經(jīng)研制出上千種疫苗用來預(yù)防和控制各種疾病。傳統(tǒng)的疫苗包括減毒活疫苗、滅活疫苗、類毒素和亞單位疫苗。雖然這些疫苗的研發(fā)在很多疾病的預(yù)防和控制中已經(jīng)取得了很大的成就，但是傳統(tǒng)的疫苗也存在著死疫苗滅活不全和活疫苗毒力恢復(fù)等缺點(diǎn)，并且在許多胞內(nèi)寄生病原的疫苗研發(fā)上這些途徑表現(xiàn)出了很大的限制性。因此能夠研制出更安全、有效、廉價(jià)并且易于推廣的新型疫苗來彌補(bǔ)傳統(tǒng)疫苗的缺陷是人們所面臨的又一個(gè)新的挑戰(zhàn)。隨著DN

2、A重組技術(shù)的出現(xiàn)和成熟，利用基因工程開發(fā)新疫苗是當(dāng)前解決這些問題的最好途徑。
　　基因工程疫苗是用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)病原微生物的基因組進(jìn)行改造，以降低其致病性，提高其免疫原性，或者將病原微生物基因組中的一個(gè)或多個(gè)對(duì)防病治病有用的基因克隆到無毒的原核或真核表達(dá)載體上制成疫苗，接種動(dòng)物產(chǎn)生免疫力和抵抗力，達(dá)到防制傳染病的目的。核酸疫苗又名基因疫苗或DNA疫苗，是基因疫苗的一種。
　　肌肉注射是DNA疫苗的常用接種方式。骨骼肌是機(jī)體

3、最大的細(xì)胞群，也是接種DNA疫苗的常用部位。骨骼肌接種疫苗后，其編碼的蛋白質(zhì)由多種細(xì)胞表達(dá)也包括骨骼肌細(xì)胞在內(nèi)。如一些專職抗原提呈細(xì)胞可直接被轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)移至引流淋巴結(jié)并始動(dòng)免疫應(yīng)答，樹突狀細(xì)胞則可通過交叉抗原提呈途徑將非免疫活性細(xì)胞產(chǎn)生的抗原提呈給免疫活性細(xì)胞誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。而肌細(xì)胞在DNA免疫中的作用在已有的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果中存在差異，一些研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染的肌細(xì)胞MHCⅠ類分子和B7-1表達(dá)上調(diào)，認(rèn)為它可能在維持專職抗原提呈細(xì)胞始動(dòng)的免疫應(yīng)答的程度

4、和持續(xù)時(shí)間上起作用，而另一些研究則表明肌細(xì)胞表達(dá)的抗原導(dǎo)致的是CD8+T細(xì)胞的耐受。因此，總體來說肌細(xì)胞在DNA免疫中的作用仍有待我們進(jìn)行更深入的研究和探討。
　　PD-1是負(fù)性調(diào)節(jié)因子，其配體為PD-L1和PD-L2。PD-L1可在專職抗原提呈細(xì)胞、非專職抗原提呈細(xì)胞及肌細(xì)胞表達(dá)。而PD-L2只在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上呈誘導(dǎo)表達(dá)。PD-1/PD-L1為負(fù)性免疫調(diào)節(jié)信號(hào)通路，在很多慢性疾病感染過程中PD-1在特異性免疫活性細(xì)胞上高

5、表達(dá)，并且使之功能失活，這說明肌細(xì)胞在DNA疫苗免疫后，一方面通過表達(dá)抗原通過交叉抗原提呈途徑將抗原肽提呈給免疫活性細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。另一方面可能在建立自我保護(hù)的過程中提供負(fù)性信號(hào)抑制免疫應(yīng)答。這可能是造成質(zhì)粒DNA疫苗免疫保護(hù)作用不高的原因之一。
　　基于上述考慮，本實(shí)驗(yàn)以小鼠肌細(xì)胞為研究對(duì)象，用質(zhì)粒免疫小鼠，以觀察小鼠肌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子PD-L1，CD80的變化情況，以探討其在基因疫苗免疫中的作用及意義，為提高DNA疫苗的免疫

6、保護(hù)作用開辟新途徑。
　　方法:(1)質(zhì)粒免疫小鼠肌細(xì)胞:體重20g左右的C57BL/6小鼠，股四頭肌肌肉注射質(zhì)粒pcDNA3/VP-1(100ug/只)。(2)Trizol提取總RNA:分別在1天、3天、5天、7天提取總RNA，以DEPC水處理組作為正常對(duì)照組，進(jìn)行Real Time PCR。
　　結(jié)果:(1)用PCDNA3.0/VPl免疫小鼠后，Real Time PCR的結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組PD-L1的mRNA表達(dá)在3天的時(shí)

7、候達(dá)到高峰，5天、7天時(shí)開始緩慢下降;實(shí)驗(yàn)組CD80的mRNA表達(dá)在3天時(shí)達(dá)到高峰，其余時(shí)間都維持在較低的水平;對(duì)照組的PD-L1和CD80則普遍維持在較實(shí)驗(yàn)組低的水平;對(duì)照組的CD80水平較PD-L1高。
　　結(jié)論:(1)質(zhì)粒DNA免疫C57BL/6小鼠肌細(xì)胞后使得小鼠肌細(xì)胞內(nèi)的PD-L1及CD80 mRNA表達(dá)出現(xiàn)波動(dòng)性的變化。(2)與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的PD-L1及CD80的mRNA表達(dá)普遍上調(diào)。(3)正常肌肉組織內(nèi)也構(gòu)成性