CVB3感染小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞后病毒滴度及PD-L1與IFN-β的表達(dá)情況.pdf

1、目的:病毒性心肌炎屬于感染性心肌疾病，可由多種病毒感染引發(fā)，其中腸道病毒尤其是柯薩奇病毒B3(Coxsackie virus B3，CVB3)是引起病毒性心肌炎最常見的原因。CVB3引發(fā)的病毒性心肌炎主要可引起病毒直接損傷與病毒感染后引起機(jī)體免疫炎癥性損傷。病毒性心肌炎甚至可發(fā)展為擴(kuò)張性心肌病。目前治療病毒性心肌炎，臨床缺乏有效的特異的治療方法。因此對CVB3感染引起病毒性心肌炎的過程及干預(yù)辦法的研究都勢在必行。而心臟中有50％的細(xì)胞為

2、成纖維細(xì)胞，心臟中最有功能的細(xì)胞為心肌細(xì)胞，因而有必要對CVB3感染機(jī)體后CVB3在心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞內(nèi)的變化情況以及這兩種細(xì)胞對CVB3刺激后的反應(yīng)情況進(jìn)行深入研究，為研究病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過程及有效治療提供依據(jù)。
　　方法:(1)C57BL/6小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng):無菌取C57BL/6新生小鼠心臟，剪碎，經(jīng)胰酶及Ⅱ型膠原酶消化后收集細(xì)胞至6孔板中，1.5小時差速貼壁， CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(2)小鼠心

3、肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞感染柯薩奇病毒后培養(yǎng)并觀察細(xì)胞病變，分別取第1天，第2天，第3天，第4天，第5天，第7天，第9天的細(xì)胞上清液。(3)收集到的細(xì)胞上清液分別用Hela細(xì)胞測定病毒滴度。(4) Trizol提取細(xì)胞總RNA:心肌細(xì)胞感染柯薩奇病毒后，分別在1天、3天、5天、7天、9天后提取細(xì)胞總RNA;心臟成纖維細(xì)胞感染柯薩奇病毒后，分別在3小時、6小時、12小時、24小時、48小時、72小時后提取細(xì)胞總RNA，未處理組作為正常細(xì)胞對

4、照組，進(jìn)行Real Time PCR。
　　結(jié)果:(1)小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞可進(jìn)行體外培養(yǎng)且生長良好。(2)小鼠心肌細(xì)胞感染柯薩奇病毒后部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，取不同時間點的細(xì)胞上清液，感染Hela細(xì)胞，測定到病毒滴度-lgCCID50前4天逐漸下降，第5天、7天、9天水平為0;小鼠心臟成纖維細(xì)胞感染柯薩奇病毒后少量細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，取不同時間點的細(xì)胞上清液，感染Hela細(xì)胞，測定到病毒滴度-lgCCID50前2天逐漸下降，

5、第3天至第9天水平為0。(3)用柯薩奇病毒感染心肌細(xì)胞后，Real Time PCR的結(jié)果顯示PD-L1的mRNA表達(dá)在1天、3天持續(xù)升高，在3天達(dá)到高峰，5天略有下降，7天、9天降至正常水平以下;IFN-β的mRNA表達(dá)在1天略有下降，在3天達(dá)到第一個高峰，5天、7天降至正常水平，9天達(dá)到最高峰。用柯薩奇病毒感染心臟成纖維細(xì)胞后，Real Time PCR的結(jié)果顯示PD-L1的mRNA表達(dá)在3小時略有下降，6小時回到正常水平，12小時

6、、24小時逐漸升高，48小時、72小時降至正常水平;IFN-β的mRNA表達(dá)在3小時略有升高，6小時、12小時逐漸降至正常水平，24小時、48小時逐漸升高，72小時達(dá)到最高峰。
　　結(jié)論:(1) CVB3感染早期主要破壞部分小鼠心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，對心臟成纖維細(xì)胞損傷不明顯，在體外培養(yǎng)小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞不增殖。(2)正常小鼠心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞構(gòu)成性表達(dá)PD-L1和IFN-β mRNA。(3) CVB3感染小