補(bǔ)陽還五湯抗動(dòng)脈粥樣硬化炎癥機(jī)制及對(duì)炎性細(xì)胞因子表達(dá)譜的影響.pdf

1、隨著社會(huì)的發(fā)展和生活水平的提高，感染性疾病所導(dǎo)致的死亡不斷減少，而動(dòng)脈粥樣硬化疾病導(dǎo)致的死亡迅速增多，目前已成為全球人口死亡的首位原因。高熱量、高飽和脂肪酸食物攝入過多以及缺乏體力活動(dòng)等不良生活方式是其元兇。 動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心臟病、腦血管病等心腦血管疾病的病理基礎(chǔ)?？箘?dòng)脈粥樣硬化藥的應(yīng)用，對(duì)防治心腦血管疾病具有重要的戰(zhàn)略意義。雖然人類認(rèn)識(shí)動(dòng)脈粥樣硬化是一種疾病并對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研

2、究也有100余年的歷史，而AS的發(fā)病機(jī)制至今尚未明確。隨著動(dòng)脈粥樣硬化研究的不斷深入，AS中新的細(xì)胞因子不斷檢出，使炎癥已成為AS發(fā)生發(fā)過程中的重要因素。特別是炎癥標(biāo)志物，高敏C-反應(yīng)蛋白（1 s-CRP），白細(xì)胞介素-1（IL-8），可溶性粘附因子（sICAM-1），P-選擇素（P-selsctin）、可溶性血管細(xì)胞粘附因子（sVCAM-1），整合素（Dll/CD18等均在動(dòng)脈粥樣硬化中有表達(dá)并發(fā)揮作用。 從中醫(yī)臨床來說，雖然

3、沒有動(dòng)脈粥樣硬化的概念，但根據(jù)病因，臨床表現(xiàn)，并發(fā)癥等特征，散見于中醫(yī)“胸痹”“中風(fēng)”，“眩暈”，“頭痛”，“痰證”，“瘀證”等的記載中，但不單指一種病?？偛C(jī)可概括為為本虛標(biāo)實(shí)之證，本虛為脾虛，心脾虛，腎虛，標(biāo)實(shí)為氣滯，血瘀，痰濁。治療多以活血化瘀、消食化痰、利水滲濕、補(bǔ)虛扶正為大法。中醫(yī)藥對(duì)于抗動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制的研究具有多層次，多角度，多靶點(diǎn)的特征，主要從調(diào)節(jié)血脂紊亂、保護(hù)血管內(nèi)皮、抑制血栓形成和抑制i缸管平滑肌增殖、抗炎、抗氧化、

4、改善血流變等途徑。補(bǔ)陽還五湯是晚清名醫(yī)王清任所創(chuàng).主治中風(fēng)后遺癥中屬正氣虧虛而致血脈不利者?，F(xiàn)代研究證明，補(bǔ)陽還五湯有改善血液流變學(xué)，降血脂，抗血栓，改善心肌缺血，抗動(dòng)脈粥樣硬化，對(duì)周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)等作用。而其對(duì)于氣虛血瘀心腦血管病已獲得醫(yī)學(xué)界的重視。但抗動(dòng)脈粥樣硬化藥理機(jī)制研究尚缺乏系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)。 目的: 本研究擬采用載脂蛋白E（apolipoprotein E，ApoE）基因敲除小鼠（ApoE-/-）復(fù)制模型，研究中

5、藥復(fù)方補(bǔ)陽還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的防治作用，同時(shí)利用蛋白液相芯片系統(tǒng)研究動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)以及補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)譜變化，并采用蛋白遷移率實(shí)驗(yàn)及蛋白凝膠實(shí)驗(yàn)等分子生物技術(shù)初步驗(yàn)證細(xì)胞因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，闡述動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥形成機(jī)制和補(bǔ)陽還五湯的作用機(jī)理，為臨床治療動(dòng)脈粥硬化引起的心腦血管病提供理論基礎(chǔ)。 方法: 24只雄性Apo E-/-小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，分別為模型組（Apo E-/-+高脂），

6、補(bǔ)陽還五湯組（Apo E-/-+高脂+補(bǔ)陽還五湯），舒降之組（Apo E-/-+高脂+舒降之），并以8只雄性C57BL/6J（Apo E-/-小鼠來源于C57BL/6J）作為空白對(duì)照組.所有動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后，模型組，舒降之組，補(bǔ)陽還五湯組高脂飼料喂養(yǎng)造模。補(bǔ)陽還五湯組灌服補(bǔ)陽還五湯口服液，每日一次；舒降之組給予辛伐他汀灌胃，每日一次，其他組灌服等劑量生理鹽水。連續(xù)灌胃14周。 造模造模后，眼球取血，分離血清，酶法檢測(cè)血脂四項(xiàng)

7、。取出心臟和主動(dòng)脈，并將其再分成兩部分，一部分沿心房尖間劃線形成的平面切除下面部分，再放入10%中性福爾馬林溶液中固定，一部分放入-80℃冰箱中保存。 福爾馬林溶液固定后的心肌組織常規(guī)石蠟包埋、切片。從心臟向血管的方向連續(xù)切片。從主動(dòng)脈瓣出現(xiàn)到消失，即主動(dòng)脈竇區(qū)域。HE染色或油紅0染色觀察各組的病理變化。 使用LiquiChip蛋白液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)組織細(xì)胞因子，LINCO公司的試劑盒可以同時(shí)檢測(cè)mIL-1α、mlL-1β

8、、mlL-、mIL-5、mIL-6、mIL-7、mIL-9、mIL-10、mlL-12p70、 mIL-13、 mIL-15. mIL-17、 mIFN-γ、 mTNF-α、mGM-CSF、mMIP-1a、mMCP-1、mKC、mRA TES、mIP-10、mG-CSF。 部分心肌組織用Western及IP細(xì)胞裂解液提取心肌組織蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行蛋白（）跡實(shí)驗(yàn)。以β-actin為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品

9、進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗和二抗，ECL顯色，Kodak Image Station2000MM成像系統(tǒng)采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件Image Tool3.0測(cè)定并分析條帶平均積光密度值以檢測(cè)p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的表達(dá)水平。 部分心肌用核蛋白漿蛋白提取試劑盒提取核蛋白，Bradford法進(jìn)行蛋白定量，進(jìn)行凝膠蛋白遷移率試驗(yàn)

10、（EMSA）。處理好樣品SDS-PAGE分離，加樣前預(yù)電泳，加樣電泳直至酚藍(lán)達(dá)到凝膠頂部3/4處停止，然后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上，加入ECL試劑柯達(dá)2000MM圖像工作站成像。 結(jié)果: 1、補(bǔ)陽還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型病理變化的影響，飼喂高脂飼料飲食，14周后處死動(dòng)物，取心臟和主動(dòng)脈，在主動(dòng)脈根部的相對(duì)應(yīng)區(qū)域進(jìn)行切片，保證樣本之間的可比性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組斑塊形成明顯，動(dòng)脈腔顯著變小，補(bǔ)陽還五湯顯著降低AS斑塊形成，與模型組有差

11、異顯著。 2、補(bǔ)陽還五湯對(duì)apoE-/-小鼠血脂的影響檢測(cè)血脂四項(xiàng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯對(duì)血脂的影響與對(duì)照組相比減少無顯著意義（P>0.05），舒降之與其他組比較，減少有顯著性意義（P<0.001）。說明舒降之能顯著的降低甘油三酯（TG）和膽固醇（CHOL）、升高HDL的作用。這與在大鼠和小鼠上的報(bào)道并不一致，可能與apoE基因缺失有關(guān)。 3、IiquiChip蛋白液相芯片系統(tǒng)檢測(cè)組織細(xì)胞因子顯示：與空白組比較，模型組（M

12、-CSF、IL-1、IL-6、IL-6和TNFa均增加有顯著性意義（P<0.001）。而與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組TNFα表達(dá)減少有顯著性意義（P<0.001）；舒降之組與模型組比較IL-1β和IL-6表達(dá)減少有顯著性意義（P<0.001）；二者與模型組比較GM-CSF減少和IL-10表達(dá)增加有顯著性意義（P<0.001）。 4、補(bǔ)陽還五湯對(duì)MAPK家族成員p38、ERK和JNK及其磷酸化蛋白P-p38、P-ERK和P-JNK的

13、表達(dá)的影響。通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯對(duì)p38及其磷酸化蛋白的表達(dá)影響與其他組比較減少無顯著性意義（P>0.05）；模型組ERK和JNK，P-ERK和P-JNK表達(dá)相對(duì)與其他組均增加有顯著性意義（P<0.001）。與模型組相比，補(bǔ)陽還五湯減少有顯著性意義（P<0.001）。說明補(bǔ)陽還五湯能降低此二者及其磷酸化水平的表達(dá)，可能是其調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制之一。 5、補(bǔ)陽還五湯對(duì)NF-κB活化的影響。應(yīng)用Pierce的

14、Lightshift chemiluminescent EMSA Kit，通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，高脂飼料能夠引起動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠NF-κ B的活化，模型組與空白對(duì)照組相比，增加有顯著性意義（P<0.001）。而與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯及舒降之組均減少具有顯著性差異（P<0.001）?？赡転橐种芅F-κB活化降低了某些細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄，可能是補(bǔ)陽還五湯抑制AS炎癥的重要機(jī)制。 結(jié)論: 1、補(bǔ)陽還五湯可明顯減輕動(dòng)

15、脈粥樣硬化的損傷程度，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的組織結(jié)構(gòu)具有明顯的保護(hù)作用。 2、補(bǔ)陽還五湯和舒降之均能通過降血脂的作用而減輕動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。 3、動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，補(bǔ)陽還五湯能明顯影響部分炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)。 4、通過蛋白水平的驗(yàn)證，補(bǔ)陽還五湯明顯降低ERK和JNK以及兩者磷酸化水平的表達(dá)，可能是其調(diào)節(jié)細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)理之一。 5、apoE-/-小鼠的動(dòng)脈粥樣硬化模型中NF