腸癌中RSPO2抑瘤的分子機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　 R-spondin家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一類重要的Wnt途徑激活因子。R-spindin2(RSPO2)作為R-spondin家族的一員，在胚胎發(fā)育，骨骼形成和肌肉分化過程中發(fā)揮著重要作用，其突變能引起Dupuytren病。一直以來RSPO2被認(rèn)為是Wnt途徑的激活劑，但它在癌癥中的作用仍不清楚。前期工作中，我們課題組發(fā)現(xiàn)在腸癌細(xì)胞HCT116和DLD1中，RSPO2能夠抑制細(xì)胞生長和腫瘤形成。本課題就其抑制腫瘤生長的

2、分子機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　 方法:
　　 1)通過克隆形成，MTT和裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)研究RSPO2對腸癌細(xì)胞增殖的影響。
　　 2)通過雙報(bào)告基因檢測RSPO2和LGR5對Wnt途徑活性的影響。
　　 3)通過Real-time PCR和免疫熒光染色分別檢測RSPO2對β-catenin和LGR5mRNA和蛋白水平的影響。
　　 4)通過Western blot檢測RSPO2對Wnt下游基因的作用。<

3、br>　　 5)通過對LGR5進(jìn)行RNA干擾和過表達(dá)，研究RSPO2對Wnt途徑的影響與LGR5的關(guān)系。
　　 6)通過相關(guān)性分析研究RSPO2和LGR5在腸癌中表達(dá)是否具有相關(guān)性。
　　 結(jié)果:
　　 1) RSPO2通過負(fù)調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路抑制腸癌細(xì)胞生長。雙報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示RSPO2能夠抑制Wnt途徑活性;Western blot檢測發(fā)現(xiàn)高表達(dá)RSPO2的LS174T和DLD1細(xì)胞

4、，Wnt途徑下游基因C-Myc、Cyclin D1和CD44表達(dá)明顯下調(diào);Real-time PCR和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RSPO2蛋白處理，DLD1和LS174T細(xì)胞的β-catenin蛋白水平明顯下調(diào)而mRNA水平未見改變。
　　 2) RSPO2對Wnt/β-catenin信號通路的抑制伴隨著LGR5上調(diào)。Western blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LS174T和DLD1細(xì)胞經(jīng)RSPO2蛋白處理后LRP6的磷酸化和β-catenin的

5、水平在1h時(shí)均發(fā)生上調(diào)，之后逐漸減弱，6h時(shí)低于起始水平;Real-time PCR和免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)RSPO2蛋白處理，DLD1和LS174T細(xì)胞LGR5的mRNA和蛋白水平均明顯上調(diào)。
　　 3)RSPO2對Wnt/β-catenin信號通路的抑制依賴LGR5表達(dá)。在DLD1細(xì)胞中干擾LGR5后RSPO2對Wnt途徑的抑制作用消失;LGR5穩(wěn)定高表達(dá)的HEK293細(xì)胞與對照組相比，RSPO2蛋白對Wnt途徑的促進(jìn)作用隨時(shí)

6、間逐漸減弱并最終表現(xiàn)為抑制;雙報(bào)告基因檢測結(jié)果顯示在HEK293細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染LGR5和RSPO2質(zhì)粒，RSPO2對Wnt途徑的促進(jìn)作用隨LGR5濃度的升高而逐漸減弱。在DLD1細(xì)胞中也出現(xiàn)類似結(jié)果。
　　 4)腸癌中RSPO2和LGR5的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。通過Real-time PCR檢測發(fā)現(xiàn)50對腸癌樣本中有36對LGR5表達(dá)明顯上調(diào)，并且LGR5與RSPO2的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 在LGR5高表達(dá)