促進(jìn)毛乳頭細(xì)胞體外增殖的新方法：P21的基因沉默.pdf

1、目的:毛囊是一種哺乳動物特有的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的皮膚附屬器官，富含干細(xì)胞，由神經(jīng)外胚層和中胚層交互作用形成的一個典型再生系統(tǒng)，它能誘導(dǎo)毛干和毛纖維的產(chǎn)生，其主要包含來源于間充質(zhì)的毛乳頭細(xì)胞(Dermalpapilla cells，DPCs)及真皮鞘細(xì)胞。毛乳頭細(xì)胞位于毛囊基地部，體內(nèi)外誘導(dǎo)毛囊形成及促進(jìn)毛發(fā)生長是其最重要的生物學(xué)特性，并在毛囊的發(fā)生、發(fā)展和周期性循環(huán)中起主導(dǎo)作用，且體內(nèi)外誘導(dǎo)毛囊形成及促進(jìn)毛發(fā)生長是DPCs最重要的生物學(xué)功能。但

2、是研究表明只有早期DPCs具有毛囊誘導(dǎo)能力，晚期DPCs細(xì)胞則失去這種功能。體外培養(yǎng)早期DPCs展現(xiàn)出凝集性生長特性，但隨著傳代次數(shù)不斷增加，細(xì)胞逐漸衰老，這一特性也逐漸喪失。因此，研究者認(rèn)為DPCs凝集性生長特性可能與其誘導(dǎo)毛囊形成的生物學(xué)功能有關(guān)。目前對于體外培養(yǎng)的DPCs逐漸喪失凝集性生長特性及生物學(xué)功能的原因及機(jī)制尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。細(xì)胞衰老即細(xì)胞過于老化時，可抑制細(xì)胞分裂并導(dǎo)致細(xì)胞自然死亡過程。研究認(rèn)為P21(即CDKN

3、1A)作為細(xì)胞周期蛋白激酶的廣譜抑制因子能夠誘導(dǎo)細(xì)胞老化的多效性調(diào)節(jié)劑-酰胺酶，并影響細(xì)胞衰老的許多過程，是細(xì)胞衰老過程中的關(guān)鍵基因。本實驗通過腺病毒感染DPCs來沉默P21基因，并檢測細(xì)胞的形態(tài)、增殖、周期及凋亡等變化情況，以研究P21在DPCs中的表達(dá)及其作用，并探索P21與其生物學(xué)功能是否有相關(guān)性。
　　方法:
　　1實驗分組:
　　正常組:常規(guī)傳代培養(yǎng)。
　　陰性對照組:用腺病毒HK-1p2 shRNA，

4、即空載體腺病毒感染DPCs，以排除空載體腺病毒本身的干擾。
　　陽性對照組:用腺病毒CDKN1 A-1 p2 shRNA，即沉默P21基因的腺病毒感染DPCs。
　　2毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)及腺病素轉(zhuǎn)染。將三組毛乳頭細(xì)胞一同培養(yǎng)于MSCM培養(yǎng)基中，置于溫箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。并應(yīng)用熒光顯微鏡檢測腺病毒轉(zhuǎn)染效率。
　　3對比三組毛乳頭細(xì)胞的形態(tài)改變及生物學(xué)功能。
　　4應(yīng)用掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　5應(yīng)用MTT的方法繪制

5、細(xì)胞的生長曲線。
　　6應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡。
　　7應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)、免疫組化及免疫熒光三種方法檢測P21蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)情況。
　　8應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄PCR及實時熒光定量PCR的方法檢測細(xì)胞中P21基因mRNA的表達(dá)情況。
　　9應(yīng)用SPSS16.0，以α=0.05的檢驗標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析及處理。
　　結(jié)果:
　　1體外成功培養(yǎng)人毛乳頭細(xì)胞至13代，人毛乳頭細(xì)胞腺病毒轉(zhuǎn)染HK-1p

6、2 shRNA和CDKN1A-1p2 shRNA的轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80-90％。
　　2正常組:低代次細(xì)胞展現(xiàn)明顯的凝集性生長特性，8代開始消失，隨著傳代次數(shù)增加，細(xì)胞體積變大，形態(tài)變不規(guī)則，胞質(zhì)顆粒增多;同代次陰性對照組細(xì)胞凝集性生長特性及細(xì)胞形態(tài)無明顯變化;同代次陽性對照組細(xì)胞凝集性生長惡性無明顯變化，但細(xì)胞體積稍變大，胞質(zhì)顆粒增多。
　　3掃描電鏡中陽性對照組細(xì)胞的細(xì)胞核核分葉增多，核顆粒增多。
　　4 MTT法繪制

7、三種毛乳頭細(xì)胞的生長曲線顯示:正常組中4、7、10及12代細(xì)胞生長速度依次減慢，而同代次陽性對照組細(xì)胞較正常組細(xì)胞生長速度增快。
　　5流式細(xì)胞術(shù)檢測毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡。
　　細(xì)胞G1期比例用百分比表示，細(xì)胞凋亡用％Gated值表示。流式結(jié)果顯示:正常組4代、7代及10代毛乳頭細(xì)胞G1期比例分別為:39.7667％±6.7575％、53.9667％±3.0271％及61.4667％±0.6028％，細(xì)胞凋亡率分別為:

8、2.12±0.4232、5.6433±1.3503及10.54±2.1345;而5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細(xì)胞的G1期比例分別為:47.9333％±9.7285％、51.7％±7.494％及40.1％±6.3095％，凋亡率分別是:3.3767±0.8769、7.3567±0.4387及12.3233±1.769;8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細(xì)胞的G1期比例分別為:55.5333％±1.9858％、58.8667％±4.6

9、801％及44.9667％±7.9689％，凋亡率分別是:9.4067±0.9463、13.6967±0.8838及17.9567±3.2875。
　　6流失細(xì)胞術(shù)檢測毛乳頭細(xì)胞P21蛋白的表達(dá)量用熒光指數(shù)(FI)表示，流式結(jié)果示:正常組4、7、10代毛乳頭細(xì)胞中P21蛋白的FI值分別為:2.0825±0.1923、2.4945±0.135、2.8298±0.071;5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細(xì)胞中P21蛋白的FI值分別為

10、:2.2546±0.0363、2.35±0.127及2.0278±0.1443;8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細(xì)胞中P21蛋白的FI值分別為:2.5947±0.1184、2.683±0.1984及2.4019±0.1048。
　　免疫組化的結(jié)果顯示P21蛋白定位于毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)，而陽性對照組毛乳頭細(xì)胞P21蛋白定位于細(xì)胞核及核周圍區(qū)域。
　　免疫熒光的結(jié)果顯示正常組10代毛乳頭細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)P21蛋白表達(dá)量明顯多

11、于4代及7代細(xì)胞。
　　7反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果顯示陽性對照組毛乳頭細(xì)胞的P21基因mRNA表達(dá)降低;實時熒光定量PCR結(jié)果示:正常組4、7、10代毛乳頭細(xì)胞P21基因mRNA表達(dá)量分別為:1、4.8787±0.8342及33.2018±2，536;5代正常組、陰性對照組及陽性對照組細(xì)胞中P21基因mRNA表達(dá)量分別為:1、2.7617±0.9544及0.0609±0.0342;8代正常組、陰性對照組及陽性對照組細(xì)胞中P21基因mRNA