Ezrin對UMR106細胞株生物學行為及移植瘤的生長和轉(zhuǎn)移影響的實驗研究.pdf

1、背景和目的: 骨肉瘤是青少年最常見的惡性骨腫瘤。肺轉(zhuǎn)移是目前最常見的死亡原因，一旦發(fā)生預(yù)后明顯變差，不可切除的肺轉(zhuǎn)移死亡率幾乎達100％。如何提高肺轉(zhuǎn)移治愈率一直是臨床研究的熱點和難點。臨床上約50％患者的肺轉(zhuǎn)移是在治療過程中出現(xiàn)的。如果能在治療早期采用某種方法阻止肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生，將明顯提高骨肉瘤的治愈率，是減少肺轉(zhuǎn)移致死率的最佳方法。 腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移是一個多步驟、多環(huán)節(jié)共同參與的復(fù)雜過程，眾多活性因子參與其中。Ezrin

2、被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移各環(huán)節(jié)、各通路的中心調(diào)控因子。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Ezrin與多種惡性腫瘤的預(yù)后和轉(zhuǎn)移相關(guān)。2001年，Khanna最先發(fā)現(xiàn)Ezrin在高轉(zhuǎn)移骨肉瘤細胞株明顯過度表達。后來，進一步研究證實抑制Ezrin表達能顯著下調(diào)骨肉瘤細胞在肺內(nèi)的存活能力。提示Ezrin可能成為基因治療抑制骨肉瘤轉(zhuǎn)移的一個靶點。 RNA干擾(RNA interference，RNAi)是最近發(fā)展起來的一種高效的基因沉默技術(shù)，具有特異性強、效率高、操作簡單

3、、沉默程度可控、實驗周期短、適用范圍廣、費用低等無可替代的優(yōu)點。因而，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就得到了迅猛發(fā)展，現(xiàn)已廣泛用于基因功能、腫瘤、抗病毒治療等方面的研究。目前關(guān)于Ezfin參與腫瘤轉(zhuǎn)移方面的體內(nèi)研究主要采用的是實驗性肺轉(zhuǎn)移模型，由于模型動物的限制不能如實反映臨床骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的過程，也不能研究Ezrin對原發(fā)灶的影響。因此本實驗擬在以上研究的基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建抑制Ezrin蛋白表達的shRNA干擾重組載體，下調(diào)UMR106大鼠骨肉瘤細胞株Ezfi

4、n蛋白的表達，體外研究干擾前后細胞增殖、運動、粘附和侵襲能力的改變；并以大鼠原位骨肉瘤荷瘤鼠做為腫瘤模型，體內(nèi)觀察Ezrin蛋白干擾對骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移及原位瘤生長的影響，為研究抑制骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的基因治療方法提供理論依據(jù)。 方法: (1)按照Elbashir等及Reynolds的設(shè)計原則設(shè)計并合成針對Ezrin蛋白編碼基因villin2的shRNA，并克隆入轉(zhuǎn)錄載體pGenesil-1，構(gòu)建重組質(zhì)粒pshRNA1-viUin2

5、，pshRNA2-viUin2和pshRNAHK-villin2(陰性對照質(zhì)粒)；中量提取重組質(zhì)粒，采用Lipofectamine<'TM> 2000轉(zhuǎn)染UMR1069胃肉瘤細胞，應(yīng)用RT-PCR和Western Blot法分別在mRNA和蛋白水平檢測villin2基因的干擾效果。 (2)應(yīng)用干擾效果較好的質(zhì)粒大量轉(zhuǎn)染UMR106細胞，體外應(yīng)用MTT、細胞粘附實驗和Transwell小室分別研究Ezrin蛋白干擾后細胞增殖、粘附

6、、運動和侵襲能力的變化。 (3)采用LYMR106細胞原位移植法構(gòu)建高肺轉(zhuǎn)移率的大鼠骨肉瘤模型。分別用無血清培養(yǎng)基和鼠尾膠稀釋擴增培養(yǎng)的UMR106細胞形成混懸液，原位移植至3周齡SD大鼠脛骨近端骨髓腔內(nèi)，并給予免疫抑制劑和抗感染藥物。觀察肢體成瘤及肺內(nèi)轉(zhuǎn)移情況，X線檢查骨質(zhì)改變狀況，HE染色組織學檢查確定病變性質(zhì)。 (4)應(yīng)用G418篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的UMR106細胞并進行大量擴增，按照(3)的方法建立SD大鼠原位

7、移植骨肉瘤，以正常細胞及陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的移植模型做對照，觀察原位腫瘤出現(xiàn)時間、大鼠生存時間及肺轉(zhuǎn)移的差異，并采用熒光顯微鏡和RT-PCR技術(shù)研究Ezrin蛋白被干擾細胞的體內(nèi)分布。 結(jié)果: (1)成功構(gòu)建三個重組質(zhì)粒，分別為pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2和通用陰性對照質(zhì)粒pshRNAHK-villin2；應(yīng)用Lipofectamine<'TM>2000將上述重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至UMR1

8、06骨肉瘤細胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染效率高達90％。RT-PCR檢測顯示villin2基因在mRNA轉(zhuǎn)錄水平被顯著抑制，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-Villin2分別抑制到正常細胞的23.12％和30.25％。Western Blot檢測結(jié)果與RT-PCR相似，pshRNA1-vinin2和pshRNA2-villin2分別將Ezrin蛋白抑制到正常細胞的12.32％和25.56％，pshRNA1-villin2干擾效果較好。

9、 (2)以重組質(zhì)粒pshRNA1-villin2轉(zhuǎn)染UMR106細胞干擾Ezrin蛋白表達后細胞發(fā)生以下變化：①細胞增殖能力減弱，增殖抑制率達26.63％±20.65％；②細胞粘附力降低，僅為正常細胞的52.9％；③細胞運動及侵襲能力均降低，抑制率分別45.34±5.91％和50.69±5.96％。 (3)UMR106細胞混懸液原位移植SD大鼠脛骨近端骨髓腔成功構(gòu)建了高肺轉(zhuǎn)移的大鼠骨肉瘤模型，原位成瘤率及肺轉(zhuǎn)移率均達100％。

10、X線檢查示明顯骨質(zhì)破壞和瘤骨形成，組織學檢查見腫瘤樣骨基質(zhì)形成，符合臨床骨肉瘤各項特征。培養(yǎng)基稀釋組較鼠尾膠稀釋組腫瘤形成時間早(10.0±1.65天 vs 17.8±0.87天，p<0.0001)，肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目多(155.25±36.63個vs 91.5±29.56個，p<0.0001)，大鼠生存時間短(21.4±6,67天 vs40.6±9.52天，p<0.0001)。 (4)以重組質(zhì)粒pshRNA1-villin2轉(zhuǎn)染UM

11、R106細胞，G418篩選并擴增培養(yǎng)2個月，UMR106的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞達細胞總數(shù)的50％以上，RT-PCR檢測示mRNA為正常細胞的60.25％，Western Blot檢測Ezrin蛋白降至正常細胞的50.56％。將篩選后細胞原位移植大鼠脛骨近端，結(jié)果證實：①Ezrin蛋白干擾后并未影響UMR106細胞原位腫瘤的形成，成瘤時間與正常細胞組和陰性對照組間無統(tǒng)計學差異(10.17±0.90天 vs 10.17±0.95天和10.08±0.

12、88天，p>0.05)；②存活時間較正常細胞組和HK陰性對照組明顯延長(42.8±17.28天 vs 21.3±6.72天和22.4±7.42天，p<0.0001)；③肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目明顯少于正常細胞組和HK陰性對照組(60.9±57.78個 vs 120.4±41.92個和117.6±36.48，p<0.0001)；④熒光顯微鏡和RT-PCR檢測均證實Ezrin蛋白被干擾的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞只存在于原位瘤，而未轉(zhuǎn)移到肺組織。 結(jié)論:

13、 (1)重組質(zhì)粒pshRNA1-villin2、pshRNA2-villin2均能有效抑制UMR-106骨肉瘤細胞內(nèi)Ezrin蛋白的表達，以pshRNA1一villin2干擾效果最好。 (2)Ezrin蛋白在細胞的增殖、粘附、運動和侵襲中起重要作用，Ezrin蛋白下調(diào)后可使細胞的上述能力減弱，轉(zhuǎn)移能力降低。 (3)UMR106細胞混懸液原位移植SD大鼠脛骨近端構(gòu)建的大鼠骨肉瘤模型肺轉(zhuǎn)移率高，適合于骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移的研究。