Ezrin在肝細胞癌侵襲轉移中的作用及吳茱萸硬堿對人肝癌細胞株HepG2 Ezrin生物學行為的影響.pdf

1、第一章、肝細胞癌組織中Ezrin和CD44表達的相關性研究
　　目的:了解Ezrin蛋白、CD44蛋白與肝細胞癌臨床病理特征、淋巴結轉移的關系。
　　方法:本研究應用免疫組化法(SP法)檢測Ezrin蛋白、CD44蛋白在70例肝癌的表達情況，并對它們在病理類型、臨床分期、分化程度及淋巴結轉移的不同表達進行對比分析。
　　結果:
　　1、Ezrin蛋白、CD44蛋白定位于細胞漿;
　　2、Ezrin蛋白在有淋

2、巴結轉移的肝癌中陽性率(97.67％)顯著高于無轉移者(74.07％)(P＜0.05)，提示Ezrin蛋白表達與淋巴結轉移有顯著相關性。與患者年齡，性別，腫瘤大小無關均無顯著相關性;
　　3、CD44蛋白陽性表達與淋巴結轉移有顯著相關性(P＜0.05)，有淋巴結轉移(100％)的陽性率要顯著高于無淋巴結轉移(81.48％)的陽性率。與臨床分期無顯著相關性;
　　4、在肝細胞肺癌中，Ezrin蛋白與CD44蛋白陽性表達呈正相關

3、(P＜0，05)。
　　結論:
　　1、Ezrin蛋白和CD44在肝癌組織中高表達，兩者表達呈正相關;
　　2、Ezrin蛋白在肝細胞癌中的表達與TNM分期和病理分級有關，與有無復發(fā)和轉移有關，而與其他因素均不相關;
　　3、CD44在肝細胞癌中的表達與與肝癌轉移與否有關，而與其他因素均不相關;
　　4、聯(lián)合檢測Ezrin和CD44的表達有助于綜合判斷肝癌的惡性程度和轉移潛能，為基因靶向治療提供理論依據(jù)。<

4、br>　　第二章、特異性下調(diào)Ezrin對肝細胞癌侵襲和轉移的影響及其作用機制
　　目的:應用小干擾RNA(siRNA)技術特異性下調(diào)Ezrin在肝癌細胞株HepG2中的表達，探討Ezrin在肝細胞癌侵襲和轉移中的作用及分子機制。
　　方法:通過siRNA技術特異性下調(diào)人肝細胞癌細胞株HepG2中Ezrin的表達，應用Transwell法和劃痕法對肝細胞癌侵襲、轉移能力的改變進行分析;應用免疫印跡技術檢測E-鈣鉆素，N-鈣鉆素

5、和波形蛋白(Vimentin)的表達。應用細胞黏附實驗和細胞伸展實驗觀察特異性下調(diào)Ezrin對細胞黏附特性和細胞極性形成的影響;應用明膠酶譜實驗檢測基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的活性;用免疫印跡實驗檢測細胞外基質(zhì)重構相關蛋白基質(zhì)金屬蛋白酶-2，9(MMP-2，9)的表達以及轉錄因子c-jun的表達及磷酸化狀態(tài)。
　　結果:
　　1、Transwell實驗顯示Ezrin siRNA轉染細胞每個低倍視野細胞數(shù)平均為33.8個，明顯

6、低于未轉染細胞（平均77.6個/低倍視野）和非特異性siRNA轉染細胞（平均78.7個/低倍視野），統(tǒng)計學分析表明具有顯著性差異(P＜0.05)。這表明特異性下調(diào)Ezrin可以抑制肝細胞癌的侵襲。劃痕法實驗結果顯示，24h后Ezrin siRNA轉染細胞的創(chuàng)口愈合較慢(43.8％)，而未轉染細胞(94.2％)和非特異性SIRNA轉染細胞(89.2％)創(chuàng)口基本愈合。統(tǒng)計學分析表明具有顯著差異(P＜0.05);
　　2、免疫沉淀實驗結

7、果表明，在Ezrin siRNA轉染細胞中Src的磷酸化水平明顯低于未轉染細胞和非特異性轉染細胞，統(tǒng)計學分析具有顯著差異(P＜0.05);免疫印跡實驗結果表明在Ezrin siRNA轉染細胞、未轉染細胞和非特異性轉染細胞中，Src的表達沒有差異(P＞0.05)。以上結果表明特異性下調(diào)Ezrin表達可以抑制Src的磷酸化。在Ezrin siRNA轉染細胞中N-黏鈣素、波形蛋白的表達明顯低于未轉染細胞和非特異性轉染細胞，而E-黏鈣素的表達明

8、顯高于未轉染細胞和非特異性轉染細胞，經(jīng)統(tǒng)計學分析有顯著差異(P＜0.05);
　　3、應用細胞伸展實驗對Ezrin siRNA轉染細胞的極性形成進行研究，結果表明在不同時間點Ezrin siRNA轉染細胞的伸展明顯落后于非特異性RNA轉染細胞和未轉染細胞(P＜0.05)。應用明膠酶譜技術和免疫印跡技術對Ezrin siRNA轉染細胞中MMP-2、MMP-9的表達與活性進行檢測，明膠酶譜的實驗結果顯示Ezrin siRNA轉染細胞M

9、MP-2、MMP-9的活性明顯低于非特異性轉染細胞和未轉染細胞;免疫印跡實驗結果表明Ezrin siRNA轉染細胞中MMP-2、MMP-9的表達明顯低于非特異性轉染細胞和未轉染細胞。應用免疫印跡技術檢測轉錄因子c-jun的表達及磷酸化水平，結果發(fā)現(xiàn)在Ezrin siRNA轉染細胞中，c-jun的磷酸化水平明顯降低，而c-jun的表達沒有變化。
　　結論:
　　1、特異性下調(diào)Ezrin可以抑制肝細胞癌的侵襲和轉移，這種作用是通

10、過抑制上皮-間質(zhì)轉化和參與Src信號轉導通路的調(diào)節(jié)實現(xiàn)的;
　　2、特異性下調(diào)Ezrin可以抑制肝癌細胞的黏著斑轉換、細胞極性形成和細胞外基質(zhì)的降解;Ezrin可作為肝細胞癌治療的一個重要靶點。
　　第三章、吳茱萸堿對人肝癌HepG2 Ezrin表達和生物學行為的影響
　　目的:觀察吳茱萸堿對HepG2細胞Ezrin表達的影響，探討吳茱萸堿抗腫瘤作用的可能機制。
　　方法:
　　1、用MTT法觀察吳茱萸堿對

11、HepG2細胞增殖的影響;
　　2、用集落形成法觀察吳茱萸堿對細胞集落形成的影響;
　　3、通過劃痕試驗及transwell細胞侵襲試驗進一步對吳茱萸堿作用的肝癌細胞遷移和侵襲能力進行分析;
　　4、并用Western Blot和RT-PCR檢測吳茱萸堿干預后腫瘤細胞Ezrin蛋白、磷酸化Ezrin蛋白及Ezrin mRNA表達的變化。
　　結果:
　　1、吳茱萸堿抑制HepG2細胞增殖，呈時間和劑量依賴關

12、系，吳茱萸堿作用48小時，IC50約為37.283μM;
　　2、吳茱萸堿影響HepG2細胞的集落形成，呈量效關系;
　　3、細胞劃痕實驗結果表明藥物治療后肝癌細胞增殖遷移能力受到明顯抑制;
　　4、Western Blot和RT-PCR結果顯示，吳茱萸堿明顯降低Ezrin、磷酸化Ezrin及EzrinmRNA在HepG2細胞中的表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1、吳茱