雞NADb-LER基因家族的鑒定及表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、肝臟是雞脂質(zhì)代謝的主要器官，特別是產(chǎn)蛋高峰期雞，肝臟大量合成脂質(zhì)并轉(zhuǎn)運(yùn)至發(fā)育中的卵母細(xì)胞形成蛋黃。為了研究雞脂質(zhì)代謝調(diào)控的分子機(jī)制，課題組對(duì)產(chǎn)蛋前期（20周齡）和產(chǎn)蛋高峰期（30周齡）盧氏綠殼蛋雞肝臟組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，本研究通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入挖掘，鑒定出91個(gè)在產(chǎn)蛋高峰期雞肝臟組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)的新基因，通過(guò)對(duì)這些基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中5個(gè)基因具有共同的NADP結(jié)合位點(diǎn)，屬于NADB-Rossmann超家族，分別命

2、名為NADB-LER1-5。在此基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)分析手段，結(jié)合分子生物學(xué)研究技術(shù)，闡明了雞NADB-LER1-5基因家族的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究NADB-LER1-5基因家族在雞的生物學(xué)功能中奠定了基礎(chǔ)。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)對(duì)產(chǎn)蛋前期與產(chǎn)蛋高峰期雞肝臟轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深入分析，篩選獲得5個(gè)在產(chǎn)蛋高峰期顯著上調(diào)，均具有NADP結(jié)合位點(diǎn)且未注釋的基因，屬于NADB-Rossmann超家族，因此命名為NADB-L

3、ER1-5。以Ensbmel中預(yù)測(cè)的基因序列為參考序列，設(shè)計(jì)PCR引物，克隆獲得了NADB-LER1-5基因的CDS序列。生物信息學(xué)分析表明，NADB-LER1-5基因CDS區(qū)全長(zhǎng)分別為780bp、762bp、780b p、780bp、771bp;分別可編碼259、253、259、259、256個(gè)氨基酸殘基。利用NADB-LER1-5氨基酸序列構(gòu)建了NADB-LER1-5基因家族進(jìn)化樹(shù)，為這一新基因家族功能研究奠定了基礎(chǔ)。
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4、、利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)分析了產(chǎn)蛋前期（10周齡）和產(chǎn)蛋高峰期(30周齡)盧氏雞NADB-LER1-5基因的組織表達(dá)模式，并檢測(cè)了NADB-LER1-5基因在1日齡、1周齡、10周齡、15周齡、20周齡、30周齡以及35周齡盧氏雞特定組織的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，NADB-LER1-5基因具有廣泛表達(dá)的特性。NADB-LER1-4基因在脂質(zhì)代謝旺盛的器官（肝臟、腎臟、十二指腸）中表達(dá)水平較高，而NADB-LER5基因除在肝臟

5、、腎臟表達(dá)水平較高外，在心臟、胸肌和胰腺中表達(dá)水平也較高;與10周齡雞相比，30周齡雞NADB-LER1-4基因的表達(dá)在肝臟中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，在腎臟中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，在十二指腸中沒(méi)有變化，而NADB-LER5基因的表達(dá)在肝臟、心臟和胸肌中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，而在腎臟和胰臟中呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。進(jìn)一步對(duì)NADB-LER1-5基因在不同發(fā)育時(shí)期肝臟組織中的表達(dá)規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，其在性成熟時(shí)期的表達(dá)水平顯著升高（P＜005），表明，NADB-LER1-5基因可能

6、與肝臟脂質(zhì)代謝或直接與產(chǎn)蛋性能相關(guān)，同時(shí)推測(cè)NADB-LER1-5基因的表達(dá)可能受到雞體內(nèi)雌激素的調(diào)控。
　　3、以雌激素處理的青年母雞以及雞胚肝臟原代細(xì)胞為模型，分析不同處理?xiàng)l件下NADB-LER1-5基因的表達(dá)變化規(guī)律，結(jié)果顯示，雌激素處理能夠顯著上調(diào)NADB-LER1-5基因在肝臟組織和體外培養(yǎng)的肝臟原代細(xì)胞中的表達(dá)水平(P＜005)，表明NADB-LER1-5基因的表達(dá)受雌激素調(diào)控，可能參與雌激素誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝過(guò)程。

7、>　　4、為了進(jìn)一步研究雌激素調(diào)控雞NADB-LER1-5基因表達(dá)的分子機(jī)制，用17β-雌二醇分別與雌激素受體拮抗劑MPP（ERα的高度選擇性拮抗劑）、ICI182，780和tamoxifen(ERα和ERB受體的拮抗劑，且有興奮GPR30的作用)共處理雞胚肝臟原代細(xì)胞，結(jié)果顯示，MPP可完全拮抗17β-雌二醇的作用，而ICI182，780和Tamoxifen卻對(duì)17β-雌二醇的作用不具拮抗作用，表明，雌激素對(duì)NADB-LER1-5基因