放療聯(lián)合5-ALA-PDT對(duì)常氧與乏氧人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的殺傷作用.pdf

1、放療是治療惡性腫瘤的三大主要手段之一，即電離輻射通過(guò)直接或間接作用，造成蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子的損傷，以殺死癌細(xì)胞。但因某些癌細(xì)胞系對(duì)射線不敏感，實(shí)體瘤中存在著一定數(shù)量的乏氧細(xì)胞，射線因穿透力太強(qiáng)而在某些瘤體部位能量積累不夠以及長(zhǎng)期多次照射導(dǎo)致骨髓抑制、白細(xì)胞減少及惡心嘔吐等多種原因，嚴(yán)重影響了放療對(duì)某些腫瘤的治療效果及患者的順應(yīng)性。為了改善放療的療效，減弱放療導(dǎo)致的某些嚴(yán)重的副反應(yīng)，臨床上將放療與某些技術(shù)聯(lián)用，以增強(qiáng)對(duì)癌細(xì)胞的殺傷

2、作用，并降低射線劑量，以期減少長(zhǎng)期多次照射導(dǎo)致的嚴(yán)重副反應(yīng)。
　　光動(dòng)力（PDT）是借助光敏劑能夠吸收特定波長(zhǎng)光的能量，并傳遞給周圍的O2，以產(chǎn)生性質(zhì)非常活潑的單線態(tài)氧（1O2）及活性氧（ROS），破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，從而殺死癌細(xì)胞。PDT有多種優(yōu)點(diǎn)：具有組織特異性和相對(duì)選擇性，毒性低；冷光化學(xué)反應(yīng)，與其他腫瘤治療技術(shù)相輔相成；可重復(fù)用藥，無(wú)藥物耐受性；創(chuàng)傷小，見(jiàn)效快；抗癌譜廣，對(duì)各種癌癥都有一定的療效；光源局部照射，順應(yīng)性好。

3、但PDT外部光源穿透力弱，深部腫瘤作用有限，且高劑量光敏劑能導(dǎo)致光毒性副作用，病人避光時(shí)間長(zhǎng)。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)合放療與PDT兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，進(jìn)行聯(lián)用，并以人卵巢癌SKOV3作為細(xì)胞模型，分別設(shè)置常氧組和乏氧組，研究?jī)煞N技術(shù)聯(lián)用對(duì)常氧與乏氧條件下 SKOV3細(xì)胞的殺傷作用是協(xié)同作用，還是簡(jiǎn)單的加和作用，并研究聯(lián)用的機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　（一）5-ALA-PDT致SKOV3細(xì)胞損傷模型的建立

4、r>　　采用發(fā)光二極管（LED）結(jié)合BP635窄帶紅色濾光片為PDT光源，5-氨基酮戊酸（5-ALA）為光敏劑，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示：5-ALA從0.1~0.7 mM都無(wú)明顯的細(xì)胞毒作用（P>0.05）；單純紅光對(duì)細(xì)胞增殖基本無(wú)影響（P>0.05）；5-ALA>0.1mM，5-ALA-PDT隨著藥物濃度及紅光能量功率密度的增加，細(xì)胞存活率呈明顯的下降趨勢(shì)，且呈濃度和紅光能量功率密度依賴性；隨者培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率明顯降

5、低，24 h后進(jìn)入平臺(tái)期，變化緩慢。說(shuō)明5-ALA-PDT致SKOV3細(xì)胞損傷模型建立成功。
　?。ǘ㏒KOV3細(xì)胞乏氧模型的建立
　　用培養(yǎng)袋結(jié)合厭氧產(chǎn)氣袋處理SKOV3細(xì)胞12 h，用MTT法代替克隆形成法計(jì)算細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)，求得氧增比（OER）為2.61，介于2.5~3.0之間，達(dá)到乏氧條件，認(rèn)為乏氧模型建立成功。
　?。ㄈ┓暖熉?lián)合5-ALA-PDT對(duì)常氧與乏氧人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的殺傷作用
　　各組按

6、不同處理后48 h，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率。常氧與乏氧下0.1~0.7mM濃度范圍內(nèi)，5-ALA無(wú)細(xì)胞毒性與放射增敏性（P>0.05）；5-ALA>0.1 mM，隨著藥物濃度與紅光功率密度的增加，細(xì)胞存活率呈明顯的下降趨勢(shì)；X射線與5-ALA-PDT聯(lián)用，RaxRb/Rc比值分別為2.13、1.49，且常氧下聯(lián)用與順序無(wú)關(guān)（P>0.05），乏氧下有關(guān)（P<0.01）。提示常氧與乏氧下X射線與5-ALA-PDT聯(lián)用都是協(xié)同作用，但乏氧下

7、聯(lián)用效果弱于常氧，且先X射線照射后5-ALA-PDT可能會(huì)是一個(gè)更好的聯(lián)用方式。
　?。ㄋ模┓暖熉?lián)合5-ALA-PDT對(duì)常氧與乏氧人卵巢癌SKOV3細(xì)胞的殺傷作用機(jī)制
　　實(shí)驗(yàn)分為常氧組與乏氧組，兩組又各設(shè)正常對(duì)照組（N）、單純藥物組（0.3 mM）、放射加藥組（0.3 mM+6 Gy）、光動(dòng)力組（0.3 mM+0.5 J/cm2）及聯(lián)合組（6 Gy+0.3 mM-0.5 J/cm2），采用熒光顯微鏡觀察5-ALA轉(zhuǎn)化為Pp

8、IX的熒光強(qiáng)度，倒置顯微鏡結(jié)合臺(tái)盼藍(lán)單染法檢測(cè)細(xì)胞膜破損率，熒光顯微鏡結(jié)合Hoechst33342單染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞儀結(jié)合試劑盒檢測(cè)ROS含量。
　　加入0.3 mM5-ALA4 h后，無(wú)熒光的5-ALA被SKOV3細(xì)胞攝取后轉(zhuǎn)化生成有紅色熒光的PpIX，主要集中在細(xì)胞膜附近，常氧下的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于乏氧。
　　各組處理24 h或48 h后，常氧與乏氧下正常對(duì)照組和單純藥物組細(xì)胞膜破損率都無(wú)差異（P>0.05），且

9、隨著時(shí)間的延長(zhǎng)亦不顯著（P>0.05）；放射加藥組細(xì)胞膜破損率常氧高于乏氧（P<0.01），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞膜破裂增多（P<0.01）；光動(dòng)力組細(xì)胞膜破損率常氧高于乏氧（P<0.01），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，常氧不顯著（P>0.05），乏氧細(xì)胞膜破裂增多（P<0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞膜破損率常氧高于乏氧（P<0.01），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞膜破裂增多（P<0.01）；同時(shí)間點(diǎn)同組內(nèi)聯(lián)合組細(xì)胞膜破損率比單純放射加藥組、光動(dòng)力組都要高（P<0.01

10、）。
　　各組處理24 h或48 h后，常氧與乏氧下正常對(duì)照組和單純藥物組細(xì)胞凋亡率都沒(méi)有差異（P>0.05），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)亦不顯著（P>0.05）；放射加藥組細(xì)胞凋亡率常氧低于乏氧（P<0.01），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率越高（P<0.05）；光動(dòng)力組細(xì)胞凋亡率24h常氧低于乏氧（P<0.05），48h不顯著（P>0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，常氧凋亡率越高（P<0.01），乏氧不顯著（P>0.05）；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率24h常氧低

11、于乏氧（P<0.01），48h不顯著（P>0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)凋亡率越低（P<0.01）；同時(shí)間點(diǎn)同組內(nèi)聯(lián)合組24 h細(xì)胞凋亡率比單純放射加藥組、光動(dòng)力組都要高，而48 h卻都要低（P<0.05）。
　　各組處理0 h、12 h或24 h后，同時(shí)間點(diǎn)常氧和乏氧正常對(duì)照組與單純藥物組比較，ROS含量不顯著（P>0.05），同組別常氧與乏氧對(duì)應(yīng)比較亦無(wú)差異（P>0.05）；放射加藥組ROS含量常氧低于乏氧（P<0.05），隨著時(shí)

12、間的延長(zhǎng)常氧ROS含量越高，而乏氧先升高后降低（P<0.01），12 h含量最高；光動(dòng)力組ROS含量0h常氧與乏氧相比，無(wú)顯著性差異（P>0.05），而12h與24h常氧顯著低于乏氧（P<0.05），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，常氧與乏氧ROS含量先升高后降低（P<0.01），12 h含量最高；聯(lián)合組ROS含量常氧低于乏氧（P<0.01），隨著時(shí)間的延長(zhǎng)ROS含量先升高后降低（P<0.01），12 h含量最高；同時(shí)間點(diǎn)同組內(nèi)聯(lián)合組ROS含量都比單純