Urocortin對抗糖尿病腎病的發(fā)展及其機制研究.pdf

1、高糖誘導內皮細胞線粒體活性氧族(reactive oxygen species，ROS)的過度生成是包括糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN）在內的糖尿病并發(fā)癥的最主要的分子學機制。在2型糖尿病狀態(tài)下內皮依賴的血管舒張作用受到損害。腎小球胞外基質(extracelluar matrix，ECM)過度生成和降解障礙導致EcM沉積。Urocortin(UCN)是一個40個氨基酸的多肽，屬于促腎皮質激素釋放激素(cort

2、icotrophin releasing factor,CRF)家族的一員。UCN抑制內皮細胞活性氧族的釋放，誘導內皮依賴的大鼠冠狀動脈的舒張；抑制內皮細胞增殖，下調VEGF表達；誘導絨毛膜滋養(yǎng)層細胞、羊膜上皮細胞、合包體滋養(yǎng)層細胞分泌基質金屬蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase，MMP-9)，后者與基質降解密切相關。這些報道提示UCN可能與DN的發(fā)生發(fā)展有一定關聯(lián)。 本文采用腎小球系膜細胞(mesang

3、ial cell，MC)作為離體研究模型，db/db鼠和鏈佐星-弗氏完全佐劑(streptozotocin-complete Freund’Sadjuvant，STZ-CFA)聯(lián)合誘導的DN模型作為整體動物模型，研究了UCN對抗DN發(fā)展的作用及可能的作用機制。 本文的第一部分采用了體外糖基化終產物(advanced glycationend products，AGEs)生成實驗和MC作為研究對象，研究了UCN對AGEs生成及高糖

4、/AGEs作用下MC增殖、組織轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、結締組織生長因子(connective tissue growth factor,CTGF)、Ⅳ型膠原(c01lagen type Ⅳ，colla Ⅳ)表達的影響，及對TGF-β1作用下血管內皮生長因子(vascularendothelium growth factor,VEGF)分泌的影響。以熒光法測定AGEs

5、的生成，3H-TDR摻入法測定細胞增殖狀態(tài)，免疫細胞化學法測定TGF-β1、CTGF、colla Ⅳ的表達，ELISA測定VEGF的分泌。結果表明，UCN對AGEs生成沒有明顯影響，但可以抑制高糖/AGEs誘導的MC的異常增殖和TGF-β1、CTGF、collaⅣ的過度表達和TGF-β1誘導的VEGF過度分泌。而CRY受體阻斷劑astressin(AS)能減弱UCN的上述作用。 本文第二部分研究了UCN對db/db鼠腎病動物模型

6、DN發(fā)展的影響。 采用公認的2型DN模型db/db鼠為研究對象，給藥六周，連續(xù)監(jiān)測了UCN對血糖、體重、進食量的影響，并檢測了UCN對db/db鼠血漿胰島素、尿素氮(blood urine nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Crea)、AGEs、紅細胞內山梨醇(sorbitol，SB)含量、腎組織勻漿中超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)活性、丙二醛(malonaldehyde

7、，MDA)水平的影響及對腎組織病理學、腎小球ECM沉積的影響。結果表明，UCN對模型動物血糖、進食量、血漿胰島素水平沒有明顯影響，但從給藥第三周起能夠降低模型動物體重，并且能降低血漿BUN、Crea、AGEs水平、紅細胞內SB含量、腎勻漿中MDA含量，提高腎勻漿中SOD活性，減輕腎小球病理變化及腎小球系膜基質聚積和系膜區(qū)擴張。AS除不能對抗UCN降低紅細胞內SB含量的效應外，可逆轉UCN對抗db/db鼠腎病發(fā)展的保護作用。 本文

8、第三部分研究了UCN對STZ-CFA聯(lián)合誘導的糖尿病模型大鼠DN發(fā)展的影響。采用STZ-CFA聯(lián)合誘導輔以高脂飲食，連續(xù)喂養(yǎng)14周制作DN模型。連續(xù)給藥8周(自實驗開始第7周起給藥)，監(jiān)測UCN對體重、血糖的影響；生化檢測UCN對血清血糖、胰島素(放免)、BUN、Crea、總膽固醇、HDL-膽固醇、LDL-膽固醇、SOD、MDA水平的影響，收集24 h尿液，測定尿液體積、尿液中Crea、尿素氮、尿微量白蛋白(放免)水平，計算肌酐清除率；

9、觀察了UCN對腎臟病理組織學的影響及對系膜基質聚積的影響；免疫組織化學方法研究了腎小球TGF-β1、CTGF、VEGF的表達，RT-PCR方法檢測腎組織VEGF mRNA的表達。結果表明，UCN對DN大鼠血糖、胰島素、體重沒有明顯影響，但減輕腎臟重量；可以改善DN狀態(tài)下的脂代謝紊亂：降低血清總膽固醇、LDL水平，提高HDL水平；改善氧化還原失衡狀態(tài)：提高血清SOD水平、降低血清MDA水平，降低血清AGEs水平和紅細胞內SB含量；改善腎臟

10、功能：減少24 h尿液體積和微白蛋白排出量，提高尿液尿素氮、Crea水平，降低血清BUN、Crea水平，提高肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)；減輕腎小球胞外基質聚積和系膜區(qū)增寬程度，抑制腎小球TGF-β1、CTGF、VEGF、VEGF mRNA、colla IV的過度表達。除對SB的影響外，AS能夠減弱UCN對STZ-CFA誘導的DN模型的作用。此外，本文還研究了STZ-CFA輔以高脂飲食誘導的D

11、N模型腎臟UCN表達的變化。采用RT-PCR和免疫組織化學方法分別檢測UCN mRNA和UCN在腎臟組織的表達。結果表明，UCN mRNA在DN模型大鼠腎表達有增加的趨勢，但無統(tǒng)計學意義，而UCN在腎臟組織中的蛋白表達水平沒有明顯差異，由于時間所限，此結果僅為初步結果，尚需進一步實驗研究。 綜上所述，UCN能夠改善腎臟功能，減少尿微白蛋白排出，這與UCN通過多途徑對抗DN發(fā)展的機制有關：抑制MC異常增殖，抑制促纖維化因子(TGF