犬瘟熱病毒H蛋白上的SLAM受體結合表位在啟動F蛋白融合中的作用.pdf

1、分類號密級UDC單位代碼碩士學位論文犬瘟熱病毒H蛋白上的SLAM受體結合表位在啟動F蛋白融合中的作用EffectionofSLAMReceptBindingDomaininHemagglutininProteinofCanineDistemperVirustoActivateFProteinFusion研究生姓名:焦緒娜指導教師：黃娟副教授單虎教授學科專業(yè)：預防獸醫(yī)學研究方向：動物傳染病防制與生物制品學中國青島二0一七年六月青島農(nóng)業(yè)大學

2、碩士學位論文摘要犬瘟熱病毒犬瘟熱病毒H蛋白上的蛋白上的SLAMSLAM受體結合表位受體結合表位在啟動在啟動F蛋白融合中的作用蛋白融合中的作用摘要犬瘟熱(CanineDistemperCD）是由犬瘟熱病毒(CanineDistemperVirusCDV)引起的一種傳染性強、致死率高、多種動物共患的傳染病。CDV通過信號淋巴細胞激活因子（SignallingLymphocyteActivationmolecularSLAM）對宿主細胞的融合

3、作用中最關鍵的就是H蛋白和F蛋白的相互作用，H蛋白吸附到細胞表面的受體上并協(xié)助F蛋白使CDV以囊膜與宿主細胞膜發(fā)生融合的方式進入宿主細胞。CDV感染宿主后CDVH蛋白上與SLAM配體結合的關鍵區(qū)域是位于483543位氨基酸中的22個氨基酸位點，研究這些區(qū)域?qū)蛋白融合的作用有利于了解CDV感染宿主時H與SLAM受體結合時起主要作用的位點從而對以后構建反向遺傳疫苗奠定基礎，本研究主要有以下內(nèi)容:1.選擇高保真酶PrimeSTAR○RHSD

4、NA聚合酶用PCR技術以本實驗室已經(jīng)構建的pVAXCDV3載體為模板擴增出CDV3的H基因和F基因。將擴增出來的DNA片段與質(zhì)粒pcDNA3.1（）連接，經(jīng)過菌液PCR鑒定、質(zhì)粒酶切鑒定、測序鑒定確定真核表達載體構建成功，將其分別命名為pcDNA3.1H和pcDNA3.1F，用Takara質(zhì)粒提取試劑盒提取足夠的質(zhì)粒放入20℃保存，為后續(xù)試驗奠定基礎。2.將pcDNA3.1H和pcDNA3.1F用LipofectamineTM2000共

5、轉(zhuǎn)染到Vero細胞中，用RTPCR的方法檢測目的基因mRNA在細胞中的轉(zhuǎn)錄作用。瞬時轉(zhuǎn)染48小時后做間接免疫熒光試驗，檢測H蛋白表達用的一抗是抗CDVH蛋白的單抗，檢測F蛋白表達用的一抗是犬源的CDV陽性血清，細胞分別在普通顯微鏡、共聚焦顯微鏡綠色熒光通道、紅色熒光通道以及藍色熒光通道觀察。結果RTPCR檢測到目的基因轉(zhuǎn)錄，顯微鏡下觀察到了合胞體，共聚焦顯微鏡下看到了H蛋白的綠色熒光，F(xiàn)蛋白的紅色熒光，且融合后在一個合胞體上。3.對質(zhì)粒

6、pcDNA3.1H用定點突變試劑盒進行突變，成功的分別將526、527、528、529、547、548位氨基酸變?yōu)楸彼?，分別命名為pcDNA3.1H526、pcDNA3.1H527、pcDNA3.1H528、pcDNA3.1H529、pcDNA3.1H547、pcDNA3.1H548。將突變的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到Vero細胞中48小時后做間接免疫熒光試驗查看突變后的H蛋白表達情況，將突變的質(zhì)粒與pcDNA3.1F質(zhì)粒進行共轉(zhuǎn)染入Vero細胞