乙型肝炎HBVcccDNA跨單缺口和跨雙缺口實時定量PCR檢測方法.pdf

1、全世界超過4億人感染乙型肝炎病毒，其中導(dǎo)致死亡的主要原因是乙型肝炎慢性化感染?，F(xiàn)在，很多抗病毒藥物通過治療療程可以使病毒降至檢測水平以下，但停藥后很容易復(fù)發(fā)，閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）被認為是導(dǎo)致復(fù)發(fā)的主要原因。因此，監(jiān)測cccDNA的變化水平對治療乙型肝炎顯得非常重要。但是目前沒有非常成熟的HBVcccDNA熒光定量PCR檢測方法，更缺乏一種快速、準(zhǔn)確、特異性和靈敏度高、成本低、易操作的檢測方法。究其原因是各檢測方法都不同程度的存

2、在假陽性問題，主要來自RcDNA的干擾。目前主要的檢測方法有三種，即侵入者探針法（Invader assay）、嵌合引物熒光定量PCR法、選擇性熒光定量PCR法，但不管是那種檢測方法，其策略都是利用cccDNA與RcDNA結(jié)構(gòu)連續(xù)性差異而實現(xiàn)檢測的特異性。前兩者即無法排除高RcDNA背景下的影響也不能清除非規(guī)范復(fù)制造成的干擾；后者包括兩種：跨單缺口的特異引物及標(biāo)有熒光素的TaqMan特異探針、跨雙缺口的特異引物及標(biāo)有熒光素的Hybrid

3、ization特異探針。單純的跨單缺口熒光定量PCR檢測方法因不能排除非規(guī)范復(fù)制（生成雙鏈線性DNA）及高RcDNA背景造成的干擾而被認為特異性比較低，但目前許多HBVcccDNA熒光定量PCR檢測試劑盒就是應(yīng)用了跨單缺口的特異引物及TaqMan探針技術(shù)，也有不少的文獻報道使用這種試劑盒檢測HBVcccDNA含量，進一步研究cccDNA與HBV-DNA等的相關(guān)性或用來評價某種抗病毒藥物對HBVcccDNA的清除作用?？珉p缺口的熒光定量P

4、CR法能排除非規(guī)范復(fù)制造成的干擾，但不能完全排除高RcDNA背景下的干擾。許多學(xué)者采用Plasmid-safe ATP-dependent Dnase消化總DNA抽提產(chǎn)物，能有效降解RcDNA和線性DNA。目前國外許多學(xué)者比較認可的HBVcccDNA檢測方法是使用Plasmid-safe ATP-dependent Dnase進行消化，并設(shè)計HBVcccDNA跨雙缺口的熒光定量PCR法。但此方法也有其缺陷：PCR產(chǎn)物較大，在探針選擇方面

5、受到限制，常用技術(shù)要求高、操作復(fù)雜、成本高、使用受限的雜交探針（Hybridization probe），而不能選擇目前最為成熟、穩(wěn)定、易操作和成本低的TaqMan探針。
　　 目的：檢測Plasmid-safe ATP-dependent Dnase去除RcDNA、線性DNA造成干擾的效果；建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、成本低、易操作的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR檢測方法（TaqMan探針）。為證實此方法的特異性，

6、用此方法的檢測結(jié)果與建立的HBVcccDNA跨雙缺口熒光定量PCR檢測方法的檢測結(jié)果進行比較。
　　 方法：利用RcDNA與cccDNA在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上存在的差異，建立檢測HBVcccDNA病毒載量的跨單缺口（TaqMan探針）和跨雙缺口（Hybridization探針）兩種熒光定量PCR檢測方法。分別提取同一患者的血清和肝組織中的總DNA，部分抽提產(chǎn)物用Dnase消化處理，經(jīng)或未經(jīng)Dnase消化處理的樣本均用HBVcccDN

7、A跨單缺口熒光定量PCR和跨雙缺口熒光定量PCR方法檢測。分別回收HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR和跨雙缺口熒光定量PCR的PCR產(chǎn)物，對產(chǎn)物進行克隆、篩選、測序和分析，并使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析未經(jīng)Plasmid-safe ATP-dependent Dnase（簡稱為Dnase）消化的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR、經(jīng)Dnase消化的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR和跨雙缺口熒光定量PCR三種PCR

8、檢測方法的檢測結(jié)果之間是否存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 結(jié)果：成功建立了HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR檢測方法（TaqMan探針）和跨雙缺口熒光定量PCR檢測方法（Hybridization探針）。未經(jīng)Plasmid-safe ATP-dependent Dnase（簡稱為Dnase）消化的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR、經(jīng)Dnase消化的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR和跨雙缺口熒光定量PCR三種PCR檢

9、測方法的檢測結(jié)果之間存在統(tǒng)計學(xué)差異，表現(xiàn)為：血清和肝組織中經(jīng)Dnase消化后的HBVcccDNA拷貝數(shù)比未經(jīng)Dnase消化的拷貝數(shù)均顯著降低，血清Z=-3.920，P<0.000，肝組織Z=-3.920，P<0.000；血清或肝組織經(jīng)Dnase消化后，其跨雙缺口熒光定量PCR的HBVcccDNA拷貝數(shù)比跨單缺口熒光定量PCR的拷貝數(shù)均顯著降低，血清Z=-3.296，P=0.001，肝組織Z=-3.808，P<0.000；血清中未經(jīng)Dna

10、se消化的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR、經(jīng)Dnase消化的HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR和跨雙缺口熒光定量PCR的拷貝數(shù)均比肝組織的相應(yīng)實驗結(jié)果顯著降低，P<0.001。
　　 結(jié)論；Plasmid-safe ATP-dependent Dnase能夠有效降低HBVcccDNA檢測方法的假陽性問題，但不能完全消除RcDNA、線性DNA等的干擾；成功建立了HBVcccDNA跨單缺口熒光定量PCR檢測方法（Ta