C-erbB-2 siRNA對(duì)rmhTNF-α誘導(dǎo)肺腺癌Calu-3細(xì)胞株凋亡的影響.pdf

1、目的：應(yīng)用C-erbB-2基因的小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)聯(lián)合重組改構(gòu)人腫瘤壞死因子(Recombinant mutant human tumor necrosis factor-alpha，rmhTNF-α)作用于肺腺癌Calu-3細(xì)胞株，檢測(cè)癌細(xì)胞株的凋亡情況，從而探討siRNA敲除C-erb-2基因?qū)mhTNF-α僅誘導(dǎo)肺腺癌Calu-3細(xì)胞凋亡的影響，為臨床上肺腺癌患者治療的新途徑提

2、供實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。 方法： 1. 肺腺癌Calu-3細(xì)胞株的復(fù)蘇，常規(guī)培養(yǎng)：取本實(shí)驗(yàn)室凍存的細(xì)胞株，用10％滅活的胎牛血清的MEM/NEAA培養(yǎng)基，于37℃，5％CO2常規(guī)培養(yǎng)。 2. C-erbB-2基因小干擾RNA的設(shè)計(jì)：以C-erbB-2全基因序列作為模板，根據(jù)siRNA的設(shè)計(jì)原則和要求，進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)，siRNA序列如下：上游序列 5’-GCUCUUUGAGGACAACUAU-3’，下游序列 5’-AUA

3、GUUGUCCUC AAAGAGC-3’，序列經(jīng) BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)檢索證實(shí)與其它基因無(wú)同源性。由上海吉碼制藥公司設(shè)計(jì)三對(duì)siRNA及陰性、陽(yáng)性對(duì)照，并給予合成。 3．轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌Calu-3細(xì)胞消化后，以5×105個(gè)/ml接種于六孔板上，按照轉(zhuǎn)染熒光標(biāo)記siRNA的濃度分為五組，分別是：40nM、60nM、80nM、100nM和120nM組

4、，每組三個(gè)復(fù)孔。以每孔脂質(zhì)體5 μ l，siRNA分別為4 μ l、6 μ l、8 μ l、10 μ l和12 μ l配成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。加入接種有Calu-3細(xì)胞的孔板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)熒光顯微鏡下觀察綠色熒光，用Image-Pro Plus Version 6.0軟件分析積分熒光光密度，以判斷轉(zhuǎn)染效率。 4．實(shí)時(shí)熒光定量PCR(fluorogenic-quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)檢測(cè)siRNA的干擾效

5、果，篩選干擾效果最佳的siRNA：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌Calu-3細(xì)胞消化后，以5×105個(gè)/ml每孔2ml接種于六孔板上，將細(xì)胞分為8組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、GAPDH陽(yáng)性對(duì)照組、脂質(zhì)體組、554組、1309組、2621組和3882組(數(shù)字為合成四對(duì)針對(duì)C-erbB-2基因siRNA的代碼)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。根據(jù)轉(zhuǎn)染效率測(cè)定的結(jié)果，以轉(zhuǎn)染效率最佳組別siRNA的濃度轉(zhuǎn)染細(xì)胞，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱48小時(shí)。然后用T

6、RIzol試劑分別提取各組細(xì)胞總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)及瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA樣本的濃度、純度以及完整性。以各組總RNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，用MyiQTM Optical Modμle的電腦軟件分析系統(tǒng)分析實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果，篩選干擾效果最好的siRNA。 5．rmhTNF-α工作濃度的篩選：在96孔板中，按rmhTNF-α濃度(OU/μl～400U/μl)分為5個(gè)組，每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔。不同濃度的r

7、mhTNF-α作用癌細(xì)胞48小時(shí)后，應(yīng)用MTT方法檢測(cè)每組的0D值，篩選出最佳rmhTNF-α濃度。6.C-erbB-2 siRNA對(duì)rmhTNF-α誘導(dǎo)肺腺癌Calu-3細(xì)胞株凋亡的檢測(cè)： ①實(shí)驗(yàn)分組：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺腺癌Calu-3細(xì)胞消化后，以5×105個(gè)/ml每孔2ml接種于六孔板上，分4組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別是空白組、單純siRNA組、rmhTNF-α組、siRNA加rmhTNF-α組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將上述細(xì)胞移至37℃，

8、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)。 ②流式細(xì)胞儀檢測(cè)Calu-3細(xì)胞的凋亡：消化收集上述4組細(xì)胞，按照Annexin V-FITC Kit凋亡試劑盒操作，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。7.數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析，由SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)包完成。P<0.05或者P<0.01均為顯著性差異。 結(jié)果： 1.轉(zhuǎn)染效率的檢測(cè)，在siRNA轉(zhuǎn)染濃度為40nM、60nM、80nM、100nM和120nM的五個(gè)試驗(yàn)

9、組中，測(cè)得積分熒光光密度分別為62.842±1.553、82.611±1.429、93.725±2.851、106.863±0.771和107.558±4.482，不同濃度組之間轉(zhuǎn)染效率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中120nM組的轉(zhuǎn)染效率最高。但100nM組的細(xì)胞活性好于120nM組，因此100nM組的轉(zhuǎn)染效率最佳。 2.siRNA干擾Calu-3細(xì)胞后總RNA濃度及純度的測(cè)定：總RNA樣品經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，濃度為

10、0.5～2.0 μg/μ1，純度OD260/OD280為1.7～2.0，符合逆轉(zhuǎn)錄要求。經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳顯示28S、18S和5S rRNA三條帶，其中前兩者更清晰，且28S的亮度是18S的2倍左右，表明提取總RNA樣品可用作RT-PCR擴(kuò)增模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩選干擾效果最佳的siRNA，實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析顯示，空白對(duì)照組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組、554組、2621組、1309組和3882組Calu-3細(xì)胞中C-erbB-2 mRNA的

11、相對(duì)表達(dá)量分別為1.005±0.124、1.010±0.101、0.890±0.095、0.110±0.065、0.0054±0.002、0.096±0.025、0.100±0.053，各干擾組與空白組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，各干擾組之間比較結(jié)果如下：2621組與554組、1309組和3882組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，554、1309和3882三組之間兩兩比較則均無(wú)顯著性差異(

12、p>0.05)。2621組為干擾效果最佳的siRNA。 3.rmhTNF-α工作濃度的篩選：實(shí)驗(yàn)分為：0U/μ l組50U/μ l組、100U/μ l組、200U/μ l組、400U/μl組，通過(guò)MTT法檢測(cè)抑制率分別為0、14.56％±6.19％、16.32％±4.94％、27.20％±4.65％、29.68％±2.47％，各rmhTNF-α作用組與對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，200U/μl與400U/μ

13、l組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)，所以200U/μl為最佳濃度組。 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡：各組Calu-3細(xì)胞經(jīng)siRNA干擾聯(lián)合rmhTNF-α作用48小時(shí)后，凋亡率分別為：空白組7.767％±0.551％、干擾組14.400％±1.114％、rmhTNF-α組27.200％±1.650％、siRNA+rmhTNF-α組37.679％+1.349％，其中siRNA+rmhTNF-α組凋亡率最高，與其它各組比較差異有統(tǒng)計(jì)