緩激肽對離體的C6大鼠血腦腫瘤屏障鈣激活鉀電流的作用.pdf

1、緩激肽對離體的C6大鼠血腦腫瘤 屏障鈣激活鉀電流的作用 目 的 經(jīng)頸內(nèi)動脈灌注緩激肽的類似物RMP-7能選擇性增加抗癌藥卡鉑到達(dá)腦腫瘤組織，有效地延長惡性膠質(zhì)瘤病人的生存時間。因此，頸內(nèi)動脈灌注小劑量的緩激肽已經(jīng)作為選擇性開放血腫瘤屏障有效轉(zhuǎn)運抗腫瘤藥物到達(dá)腦組織的一種方法。緩激肽選擇性地引起腫瘤組織血腦屏障開放被認(rèn)為是緩激肽與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的B<,2>受體結(jié)合，激活了一氧化氮合成酶，增加了細(xì)胞內(nèi)cGMP生成的結(jié)果。近

2、來有證據(jù)表明，鈣激活性鉀通道(K<,ca>通道)和ATP敏感性鉀通道(K<,ATP>通道)存在于腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上。緩激肽灌流時能夠引起細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度增加，細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>濃度增加時，K<,ca>通道被激活。在緩激肽、NO供體、cGMP引起的血管擴張開放過程中，K<,ca>通道和K<,ATP>通道起到關(guān)鍵的作用，但是我們對K<,ca>通道和K<,ATP>通道起到關(guān)鍵作用這一結(jié)論持懷疑態(tài)度，因此進(jìn)行了如下的研究：有關(guān)緩激肽

3、開放腦腫瘤血腦屏障的研究多數(shù)集中在動物實驗上，由于在體實驗的多因素相互影響，很難判斷某一因素的關(guān)鍵作用。本實驗是應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄方法觀察緩激肽對離體培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞鈣激活鉀電流(I<,Kca>)的影響，從離子通道的角度研究緩激肽選擇性開通血腦屏障的機制，進(jìn)一步明確K<,ca>通道在其中的作用。 材料和方法 1．通過對大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄上述兩種

4、細(xì)胞鈣激活鉀電流： 將培養(yǎng)后的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞的小載玻片分別放入容積約1.OmL平放于倒置顯微鏡上的浴槽中，選取胞膜光滑完整，胞漿均勻的細(xì)胞進(jìn)行實驗。用尖端直徑為2um的膜片電極(電極電阻3～5 MΩ)進(jìn)行千兆封接。全細(xì)胞狀態(tài)形成后，用“pCIAMP 5.5.1”軟件程序發(fā)放刺激并收集記錄信號。采用保持電位為-60～+60 mV，步階脈沖10 mV，波寬0.5 s，刺激間隔3 s的方波鉗制方案進(jìn)行刺激。記錄的電流

5、在“pCIAMP 5．5.1”程序中進(jìn)行電流大小的測量。所得數(shù)據(jù)用SPSS軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。I<,Kca>幅度為刺激結(jié)束時相對于零電流水平的值，數(shù)據(jù)用x±s表示。 2．血腦腫瘤屏障體外模型的建立： C6細(xì)胞培養(yǎng)至80％～90％匯合后，將C6細(xì)胞培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)液。取“鋪路石樣”表現(xiàn)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)皿，再取與培養(yǎng)皿內(nèi)等量的C6細(xì)胞條件培養(yǎng)液，將其移人皿內(nèi)，培養(yǎng)24h。 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)至

6、80％～90％匯合后，將大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液作為條件培養(yǎng)液。取C6細(xì)胞培養(yǎng)皿，再取與培養(yǎng)皿內(nèi)等量的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞條件培養(yǎng)液，將其移入皿內(nèi)，培養(yǎng)24h。 取生長狀態(tài)良好的C6細(xì)胞和大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，將C6細(xì)胞吹打成懸浮狀態(tài)，取等同于大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液，將其移入皿內(nèi)，共同培養(yǎng)24h。 把Transwell倒置于培養(yǎng)皿中，接種大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞于Tr-answell的膜上(背面)(聚碳酯

7、膜，孔徑6.5um)，細(xì)胞貼壁后，再按正常位置放人培養(yǎng)板中，接種C6細(xì)胞于膜的另一面，培養(yǎng)條件和培養(yǎng)時間同混合細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)至匯合后，棄去原有的內(nèi)皮專用培養(yǎng)基，然后在供池中加人實驗用培養(yǎng)基100uL(含有2.48ug緩激肽)，未加入BK的一組作為對照組，受池中加入1000uL實驗用培養(yǎng)基，取出Transwell，用刀片切下。Transwell上的膜,按電鏡方法制作觀察。 把培養(yǎng)的Transwell膜迅速投入3％戊二醛+15％

8、多聚甲醛混合電鏡固定液中，經(jīng)1％鋨酸后固定后，梯度酒精脫水，環(huán)氧樹脂包埋，其中玻片上的細(xì)胞為倒扣包埋，超薄切片，Transwell的膜行縱切片，經(jīng)醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色后，透射電鏡下觀察。 應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄模式記錄血腦屏障中內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞鈣激活鉀電流。 結(jié)果： 1．指令電位為+60 mV時，1μmol·L<'-1>緩激肽可使大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞鈣激活鉀電流分別由給藥前的(770±220)p

9、A和(630±220)pA降至給藥后的(370±40)pA和(308±19)pA(n=6，P<0.01)。 2．在條件培養(yǎng)液內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞常呈梭形或橢圓形，細(xì)胞之間相互接觸，形態(tài)與非條件培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞無明顯變化；在條件培養(yǎng)液內(nèi)C6細(xì)胞常呈梭形或橢圓形，細(xì)胞之間相互接觸程度高于非條件培養(yǎng)的C6細(xì)胞；C6細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞共同培養(yǎng)后可見內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞相間分布，內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞各自之間形成聚集接觸。Transwell共同培養(yǎng)的血腦屏障模

10、型中，未給予BK處理的一組可見膜兩側(cè)面均可見到扁平狀的細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞間可見緊密聯(lián)結(jié)。給予緩激肽處理后可見緊密聯(lián)結(jié)大部份被開放。 3．指令電位為+60 mV時，1μmol·L<'-1>緩激肽可使血腦屏障中內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞鈣激活鉀電流降低。 結(jié)論 1．小劑量的緩激肽抑制大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞和C6細(xì)胞的鈣激活性鉀電流。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密聯(lián)結(jié)是血腦屏障關(guān)鍵解剖點，小劑量的緩激肽對該細(xì)胞鈣激活性鉀電流抑制是緩激肽不