轉(zhuǎn)染Brn2、Ascl1、Myt1l基因的BMSC在體外分化為神經(jīng)元樣細胞的初步研究.pdf

1、[目的]:
　　 腦卒中是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、多發(fā)病，其致殘率和病死率均很高。腦卒中治療的關(guān)鍵是重建神經(jīng)通路，重建神經(jīng)通路的前提是有新生神經(jīng)細胞的發(fā)生。成年哺乳動物腦內(nèi)神經(jīng)干細胞的發(fā)現(xiàn)，給腦卒中的治療帶來了新的曙光。但神經(jīng)干細胞的組織來源一直是這一研究領(lǐng)域最棘手的問題。
　　 骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stroma1 cell，BMSC)，是存在于骨髓基質(zhì)中一種成體干細胞，來源于中胚層，具有很強的自我增殖和多

2、向分化能力，可以分化為多種不同的組織細胞，是組織工程學研究中的一種理想種子細胞。目前國內(nèi)外研究報道骨髓基質(zhì)干細胞在體內(nèi)外可被誘導分化神經(jīng)細胞，如骨髓基質(zhì)干細胞可以被化學物質(zhì)如視黃酸、β-巰基乙醇，中藥如黃芩甙、天麻等誘導分化為神經(jīng)細胞。但是利用轉(zhuǎn)錄因子Brn2、Asc11、Myt11基因?qū)撬杌|(zhì)干細胞誘導分化的研究在國內(nèi)尚屬空白。
　　 Brn2又稱為POU3F2，是POU轉(zhuǎn)錄因子家族之一，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)當中表達。有研究表

3、明，Brn2可調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的基因表達，在哺乳動物的神經(jīng)發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Asc11基因的編碼產(chǎn)物是堿性螺旋-環(huán)-螺旋(BHLH)轉(zhuǎn)錄因子家族之一。Asc11在神經(jīng)定型、分化，以及嗅覺與自主神經(jīng)元的發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用。Myt11基因又稱為Nzf1基因，可特異性結(jié)合于視黃酸反應(yīng)原件，表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活化作用。Myt11基因可能與神經(jīng)系統(tǒng)與腦垂體的基因表達調(diào)控有關(guān)。
　　 因此，本研究擬通過克隆并構(gòu)建一個含有Brn2、Asc1

4、1、Myt11基因的慢病毒表達載體，初步探討轉(zhuǎn)染Brn2、Asc11、Myt11基因的骨髓基質(zhì)干細胞在體外分化為神經(jīng)細胞的情況，為下一步進行骨髓基質(zhì)干細胞的神經(jīng)移植或基因治療打下基礎(chǔ)。
　　 [方法]:
　　 1.用Percol1淋巴細胞分離液分離出大鼠骨髓基質(zhì)干細胞，并用含20％(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，胰酶消化傳代，擴增大鼠骨髓基質(zhì)干細胞。
　　 2.采用PCR技術(shù)克隆出長分別為696bp、1

5、338bp及3558bp的Brn2、Asc11、Myt11基因部分序列，利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建pLV.EX3d.nu1l-CMV＞mAsc11/E2A/mBrn2/F2A/mMyt11質(zhì)粒。經(jīng)酶切、PCR、DNA序列分析鑒定確定載體構(gòu)建無誤。
　　 3.取第四代、第六代BMSC，用慢病毒轉(zhuǎn)染法介導Brn2、Asc11、Myt11基因進入到骨髓基質(zhì)干細胞內(nèi)。觀察細胞形態(tài)的改變。
　　 [結(jié)果1:
　　 1.

6、大鼠BMSC的分離培養(yǎng)用Perco11淋巴細胞分離液對大鼠骨髓作密度梯度離心，所得細胞為比較均一的球形單個核細胞，臺盼蘭染色細胞活力達99％。接種培養(yǎng)10-14天后，細胞貼滿培養(yǎng)瓶瓶底，進行細胞的首次傳代。傳3-4代后，可以形成較典型的BMSC，細胞大而扁，呈梭形、三角形、多角形，折光性差，立體感不強。
　　 2.Brn2、Asc11、Myt11基因片段經(jīng)測序鑒定，克隆基因序列與GenBank收錄小鼠Brn2(NC_000070

7、.5)、Asc11(NC_000076.5)、Myt11(NC_000078.5)完全同源。并以此成功構(gòu)建Brn2、Asc11、Myt11基因的真核表達載體pLV.EX3d.nu11-CMV＞mAsc11/E2A/mBrn2/F2A/mMyt11。
　　 3.BMSC轉(zhuǎn)染帶有Brn2、Asc11、Myt11基因的表達載體后，可以觀察到胞體收縮，折光性增強，并伸出較長軸突和樹突樣突起，形態(tài)類似神經(jīng)細胞。
　　 [結(jié)論]:轉(zhuǎn)