NGX6基因?qū)Y(jié)腸癌血管形成及凋亡影響的研究.pdf

1、NGX6基因是中南大學(xué)腫瘤研究所分子遺傳室在對(duì)鼻咽癌研究中篩選克隆出的一個(gè)新基因(Genbank號(hào)AF188239)。生物信息學(xué)分析顯示：NGX6基因cDNA全長(zhǎng)2134bp，編碼蛋白含338個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量37kDa，含有2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，胞外區(qū)含有1個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域和3個(gè)糖基化位點(diǎn)，胞內(nèi)區(qū)較短，含有一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)。
　　 前期對(duì)NGX6基因的研究中發(fā)現(xiàn)：NGX6在鼻咽癌活檢組織、鼻咽癌上皮細(xì)胞株中

2、表達(dá)下調(diào)甚至缺失，在正常鼻咽組織中存在明確的表達(dá)；NGX6基因在結(jié)直腸癌中亦存在不同程度的表達(dá)下調(diào)，且伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌樣本當(dāng)中NGX6表達(dá)下調(diào)的比例(15/16)遠(yuǎn)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌樣本(25/34)；利用高通量的組織芯片進(jìn)行的原位雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NGX6基因的表達(dá)在有轉(zhuǎn)移的腫瘤組織下調(diào)更明顯，且與臨床分期相關(guān)；將NGX6基因分別轉(zhuǎn)染鼻咽癌和結(jié)腸癌細(xì)胞之后可以使鼻咽癌細(xì)胞和結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型得到部分逆轉(zhuǎn)（通過細(xì)胞周期、細(xì)

3、胞生長(zhǎng)曲線、軟瓊脂集落形成、裸鼠接種等實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)）；并使鼻咽癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的基因/蛋白質(zhì)表達(dá)譜發(fā)生某些改變及表皮生長(zhǎng)因子受體的磷酸化水平下降；利用綠色熒光蛋白發(fā)現(xiàn)NGX6的亞細(xì)胞定位主要是細(xì)胞膜。
　　 NGX6基因作為具有一個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)的膜蛋白，提示了NGX6基因參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的一種可能。NGX6基因胞外區(qū)含有1個(gè)表皮生長(zhǎng)因子(EGF)樣結(jié)構(gòu)域，EGF樣結(jié)構(gòu)域主要和受體－配體間交互作用有關(guān)，提示NGX6基因在

4、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中應(yīng)與有生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)的膜蛋白有著協(xié)同或拮抗作用。同時(shí)前期研究證明NGX6基因可以使表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)的磷酸化水平下降，提示NGX6基因可能調(diào)控EGFR通路，影響NF-κB的活化，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。
　　 在前期研究工作的基礎(chǔ)上，結(jié)合對(duì)NGX6基因生物信息學(xué)特征分析的結(jié)果，本研究為進(jìn)一步對(duì)NGX6基因功能的探討做了如下實(shí)驗(yàn)：
　　 1.利用已構(gòu)建好的pcDNA3.1(＋)/NGX6/HT-29結(jié)

5、腸癌細(xì)胞，通過雞胚絨毛尿囊膜血管(CAM)形成實(shí)驗(yàn)，將結(jié)腸癌細(xì)胞接種到雞胚絨毛尿囊膜，發(fā)現(xiàn)NGX6基因抑制了雞胚絨毛尿囊膜血管的形成；將結(jié)腸癌細(xì)胞接種到裸鼠腋前皮下，發(fā)現(xiàn)NGX6基因抑制了結(jié)腸癌種植瘤的生長(zhǎng)，將種植瘤切片分析證實(shí)NGX6基因抑制了結(jié)腸癌種植瘤內(nèi)血管的形成，抑制了種植瘤血管內(nèi)癌栓的形成，并且抑制了結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移；RT-PCR實(shí)驗(yàn)表明NGX6基因下調(diào)了結(jié)腸癌細(xì)胞及結(jié)腸癌種植瘤內(nèi)VEGF的表達(dá)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NGX6基因抑制了

6、結(jié)腸癌的血管形成，進(jìn)而影響了腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移。
　　 2.通過PI/Annexin-V雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于在體外培養(yǎng)的結(jié)腸癌細(xì)胞，轉(zhuǎn)染了NGX6基因的與未轉(zhuǎn)染的比較，凋亡并無差別，基本上全都是正常的活細(xì)胞；通過EMSA分析結(jié)腸癌細(xì)胞核蛋白，轉(zhuǎn)染了NGX6基因的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞NF-κB激活明顯受到抑制；將結(jié)腸癌細(xì)胞接種到裸鼠腋前皮下，將種植瘤通過PI/Annexin-V雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了NGX6基因的與未轉(zhuǎn)

7、染的比較，凋亡率明顯增高；與化療藥物5-Fu聯(lián)用后，NGX6基因明顯誘導(dǎo)了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明NGX6基因通過抑制結(jié)腸癌細(xì)胞NF-κB的激活，促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。
　　 NGX6基因抑制VEGF的表達(dá)以及NF-κB的激活間接說明NGX6基因在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中與EGFR信號(hào)通路起拮抗作用。本實(shí)驗(yàn)說明NGX6基因能抑制腫瘤血管形成以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，此結(jié)果為證實(shí)NGX6基因是一個(gè)抑瘤基因提供一個(gè)強(qiáng)有力的證明。結(jié)腸癌