t-PA通過ERK和P38途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞VEGF表達的實驗研究.pdf

1、第一部分VEGF165和t-PA雙基因共表達載體的構建
　　 目的：構建由pIRES載體介導的攜帶育血管內(nèi)皮生長因子基因(VEGF165)及組織型纖溶酶原激活物基因(t-PA)的雙基因共表達載體，為聯(lián)合上述兩種基因共表達治療下肢深靜脈血栓形成提供載體基礎。
　　 方法：①設計引物后，ECV304細胞提取總RNA，經(jīng)逆轉錄(reversetranscription)得到目的基因的cDNA，經(jīng)PCR得到目的基因擴增片段；②將

2、VEGF165基因全長序列克隆至pMD10-Tsimple載體，構建p-MD19-T-VEGF165KpnI/EcoRI，并通過PCR、酶切和測序方法加以鑒定；③采用KpnI和EcoRI分步酶切法，分別酶切pMD19-T-VEGFKpnII/EcoRl重組質粒反pIRES載缽，圓收目的片段，構建VEGF165單基因表達載體pVEGF165-IRES;④t-PA基因RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收純化，與pMD19-Tsimpl載體連接，用Xb

3、aI和NotI雙酶切、測序加以鑒定；⑤用XbaI和Notl分別酶切pMDl9-T-t-PAXbalI/Notl及pVEGF165重組載體，并分別回收t-PA基因目的片段和pVEGF165-IRES載體片段，構建pVEGF165-IRES-t-PA雙基因真核共表達載體。
　　 結果：①成功從人臍靜脈內(nèi)皮細胞株ECV304細胞中克隆出VEGF165和t-PA基因；②成功構建pVEGF165-IRES-t-PA雙基因真核共表達載體；③

4、體外轉染血管內(nèi)皮細胞后，t-PA基因的蛋白表達量較VEGF165基因的蛋白表達量低(30.6％)，未達到實驗預期目的。
　　 結論：由IRES介導的雙基因表達載體的下游基因表達量較低，該重組質粒轉錄后的表達是不等量的，需進一步探討提高下游基因的表達量并延長其表達時間的有效方法以增強其治療效應。
　　 第二部分t-PA通過ERK和P38途徑調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞VEGF的表達
　　 實驗一人t-PA腺病毒表達載體的構建<

5、br>　　 目的：構建攜帶組織型纖溶酶原激活物(t-PA)的重組腺病毒(Adt-PA)。
　　 方法：t-PA基因克隆至腺病毒穿梭質粒pAdtrack-CMV中，構建成pAdtrack-CMV-t-PA。pAdtrack-CMV-t-PA線性化后轉化含有腺病毒骨架質粒pAdeasy-1的大腸桿菌BJ5183感受態(tài)細菌中，實現(xiàn)細胞內(nèi)同源重組。線性化重組質粒轉染HEK293細胞．包裝成重組腺病毒顆粒Adt-PA。擴增重組腺病毒載體

6、，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達，并對其進行酶切鑒定及病毒PCR鑒定。
　　 結果：經(jīng)酶切鑒定及病毒PCR鑒定和綠色熒光觀察，證實成功構建了攜帶t-PA的重組腺病毒Adt-PA。經(jīng)過兩輪擴增后，病毒滴度可以達到2.56×109pfu/ml，該病毒滴度已能滿足后續(xù)實驗的要求。
　　 結論：本實驗成功構建了Adt-PA，病毒經(jīng)擴增、純化后滴度達到后續(xù)實驗要求。
　　 實驗二t-PA影響VEGF表達的研究
　　

7、目的：檢測轉染了重組腺病毒(Adt-PA)的ECV304細胞中VEGFmRNA轉錄和蛋白表達水平，以評估t-PA對ECV304細胞VEGF表達的影響。
　　 方法：取生長活躍的ECV304細胞，轉染不同病毒滴度t-PA，轉染比率（細胞：病毒）分別為l:10、1:50、1:100，觀察細胞增殖情況，選取合適MOI值；將Adt-PA轉染ECV304細胞后使用Westemblot方法檢測細胞內(nèi)t-PA蛋白的表達；然后將ECV304細胞

8、分為2組，分別在培養(yǎng)液中加入Adt-PA作為治療組及空病毒Ad作為對照組，混合培養(yǎng)后選取24h和48h兩個時間點使用RT-PCR實驗結合凝膠成像系統(tǒng)分析ECV304細胞中VEGFmRNA的轉錄水平，Westemblot實驗檢測ECV304細胞中VEGF蛋白的表達水平。
　　 結果：當MOI為1:50時對ECV304細胞增殖具有一定的促進作用；而1：100時對細胞生長影響明顯；Adt-PA轉染ECV304細胞后在72h內(nèi)隨著時間的

9、延長其蛋白表達量也逐漸升高；ECV304細胞被Adt-PA轉染后，其細胞內(nèi)VEGFmRNA的轉錄水平和VEGF蛋白的表達量在24h和48h兩個時間點較對照組均有明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 結論：外源性t-PA可顯著增加ECV304細胞中VEGFmRNA的轉錄和蛋白表達水平。
　　 實驗三t-PA影響VEGF表達的相關信號通路研究
　　 目的：研究外源性t-PA增加ECV304細胞中VEGFmR

10、NA轉錄和蛋白表達水平過程中可能涉及的信號傳導通路。
　　 方法：將培養(yǎng)的ECV304細胞分為空病毒轉染組(Ad)和轉基因組(Adt-PA)，在兩組細胞培養(yǎng)液中分別加入Adt-PA和Ad后共同培養(yǎng)，Westernblot檢測2組Oh、24h、48h和72hERK/P38/JNK磷酸化水平；為證明ERK信號通路在介導t-PA上調(diào)ECV304細胞VEGF表達過程中的作用，我們應用該通路的特異性阻斷劑PD98059(PD)干預信號傳導

11、，以觀察VEGF的表達變化，實驗分組如下：空病毒組(Ad)、PD組、Adt-PA組和Adt-PA+PD組，Westemblot檢測VEGF蛋白表達水平及ERK的磷酸化水平；為證明P38信號通路在介導t-PA上調(diào)ECV304細胞VEGF表達過程中的作用，我們再應用該通路的特異性阻斷劑SB203580(SB)干預信號傳導，以觀察VEGF的表達變化，實驗分組同上，Westemblot檢測VEGF蛋白表達水平及P38的磷酸化水平；分別以PD和S

12、B作用于ECV304細胞并采用Westemblot方法檢測ERK和P38磷酸化水平變化以辨明ERK和P38信號通路的上下游關系。
　　 結果：Adt-PA轉染ECV304細胞后可明顯激活ERK和P38，且隨著時間的延長，磷酸化ERK(pERK)和磷酸化P38(p-P38)水平呈逐漸升高的趨勢，磷酸化JNK水平無明顯變化。兩組pERK和p-P38值在24h、48h和72h相比，差異均有顯著性；分別加入PD和SB的ECV304細胞中

13、VEGF蛋白的表達量明顯下降，且同一組的pERK和p-P38水平下降明顯(p<0.01)。轉染Adt-PA后可使ECV304細胞中ERK的磷酸化水平增加，此種效應可被ERK信號通路的特異性阻斷劑PD所抑制，但不被P38信號通路特異性阻斷劑SB所抑制；同時，Adt-PA可促進ECV304細胞中P38激酶的磷酸化水平增加，此種效應可被SB所阻滯，并可被PD所抑制。
　　 結論：Adt-PA轉染ECV304細胞后上調(diào)VEGF表達的過程