Dll4-Notcht通路對胰腺癌藥物轉(zhuǎn)運及化療耐藥性影響的實驗研究.pdf

1、1.研究背景:
　　 胰腺癌為惡性程度最高的消化道腫瘤,每年因罹患胰腺癌而致死亡的患者人數(shù)在腫瘤致死患者數(shù)中位列第四,胰腺癌患者的5年生存率<5％。少于20％的胰腺癌患者可接受根治性手術(shù)治療,因此化療是目前胰腺癌治療的最主要方法。但即使是吉西他濱單藥化療這一數(shù)十年來最為行之有效的胰腺癌標準保守療法,腫瘤反應率也僅有10％,而患者生存相關(guān)指標也僅得到了輕微改善(約6個月)。傳統(tǒng)化療方法不僅療效欠佳同時對正常組織的有較大的毒副作用,

2、由此,研發(fā)新的治療策略克服胰腺癌高度化療耐藥是急需解決的難題。
　　 腫瘤血管生成被認為是大多數(shù)腫瘤發(fā)生及進展的必要條件,同時,不具備正常形態(tài)與功能的腫瘤血管又可極大的影響化療藥物轉(zhuǎn)運及療效。2009年Olive等發(fā)表于Science的研究報道指出,血管生成并非是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的前提,而腫瘤血管灌注改善可帶來化療藥物在胰腺癌內(nèi)的轉(zhuǎn)運增加,這不僅解釋了胰腺癌耐受抗血管療法的原因,也指出了胰腺癌高度化療耐藥的重要機制。
　　

3、 Notch通路可直接調(diào)節(jié)細胞分化、增殖與凋亡等生物學行為,近來的研究顯示Notch通路在調(diào)控血管生成的同時也對腫瘤進展發(fā)揮著重要作用,而Notch通路各基因在胰腺癌中的高表達可能成為一個潛在的治療靶點。D114作為VEGF下游的負性調(diào)控因子,是Notch通路中對血管生成發(fā)揮決定性調(diào)節(jié)作用的配體,研究顯示D114的表達并不僅限于血管內(nèi)皮細胞,在多種腫瘤細胞的胞漿及胞核中也觀察到了D114的異常表達；更重要的是,已有研究發(fā)現(xiàn)D114在腫瘤

4、細胞的異常表達與NF-kB活性及腫瘤干細胞等直接相關(guān)；同時,研究發(fā)現(xiàn)Notch通路在胰腺癌細胞中的激活是依賴于配體的,而D114卻在胰腺癌細胞中出現(xiàn)了不均一的高表達。這些研究提示D114／Notch通路在腫瘤進展中可能發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。
　　 在本實驗中我們首先利用Real-time PCR及Western-Blot技術(shù)研究了D114／Notch在胰腺癌臨床標本中的mRNA及蛋白表達情況,并發(fā)現(xiàn)D114及其主要受體(Notc

5、h1／4)出現(xiàn)了程度不等的表達升高；隨后,在胰腺癌細胞系中進一步研究D114／Notch異常激活對胰腺癌細胞系化療耐藥等生物學行為的影響；最后,在體內(nèi)實驗中探討了D114／Notch通路對胰腺癌化療藥物轉(zhuǎn)運產(chǎn)生的影響。
　　 2.試驗方法:
　　 2.1D114及其主要受體(Notch1／4)在胰腺癌標本中的表達:Real-timePCR及免疫組化在42例胰腺癌臨床標本中分別檢測了D114／Notch1／Notch4的m

6、RNA或蛋白表達水平；
　　 2.2構(gòu)建D114-pc DNA3.1載體并建立D114穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細胞系:為了進一步研究在臨床標本中出現(xiàn)的D114／Notch高表達是否對胰腺癌的高度化療耐藥特性等生物學行為產(chǎn)生影響,我們構(gòu)建了D114-pc DNA3.1載體,并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染建立了D114穩(wěn)定表達的胰腺癌細胞系；
　　 2.3過度激活D114／Notch通路對胰腺癌細胞系生物學行為的影響:我們通過CCK-8、MTT法、軟瓊

7、脂克隆形成等方法分別檢測了D114／Notch對胰腺癌細胞系增殖、化療耐藥性及停泊非依賴性生長的影響,并通過Real-time PCR初步研究了可能參與D114／Notch通路影響胰腺癌細胞系化療耐藥性的機制；
　　 2.4過度激活D114／Notch通路對胰腺癌細胞系促血管生成相關(guān)功能影響的體外實驗研究:將D114穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系(1／2.5×105)種于六孔板中培養(yǎng)36h后檢測上清液中VEGF含量,并通過Real-time PCR

8、檢測相關(guān)基因表達變化；
　　 2.5體內(nèi)試驗研究D114／Notch對胰腺癌血液灌注及化療藥物轉(zhuǎn)運的影響:在荷瘤鼠體內(nèi)通過DCE-MRI、熒光與DOX灌注,并利用激光共聚焦顯微鏡觀察研究了腫瘤血液灌注與化療藥物轉(zhuǎn)運的改變；
　　 2.6體內(nèi)試驗研究D114／Notch對胰腺癌化療耐藥性的影響:將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染D114-pcDNA3.1或空載體的胰腺癌細胞系注射于裸鼠皮下成瘤,對兩組荷瘤鼠給于吉西他濱化療,通過測量瘤體大小并通過

9、Tumor=a×b2／2計算腫瘤體積,研究D114／Notch對胰腺癌化療耐藥性的影響。
　　 3.試驗結(jié)果:
　　 3.1D114／Notch1／Notch4表達水平出現(xiàn)程度不等的升高:通過免疫組化試驗發(fā)現(xiàn)D114在大多數(shù)胰腺癌組織的腫瘤細胞出現(xiàn)了程度不一的表達量升高,而且表達陽性率具有統(tǒng)計學意義,通過Real-time PCR可見D114／Notch1／Notch4mRNA表達水平在部分胰腺癌組織升高；
　　

10、 3.2成功構(gòu)建D114-pcDNA3.1載體及穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細胞系:從人胎盤組織擴增人D114全長,利用分子克隆方法構(gòu)建D114-pcDNA3.1(+)質(zhì)粒并經(jīng)測序鑒定無誤,隨后通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染目的載體或空載體,利用G418篩選構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系,并通過Real-time PCR及Western-blot驗證；
　　 3.3過度激活D114／Notch通路對胰腺癌細胞系的影響:D114／Notch通路不影響胰腺癌細胞克隆形成能力,但明顯

11、減緩細胞體外增殖速度,并可增強早期胰腺癌多藥化療耐藥性,通過Real-time PCR發(fā)現(xiàn)DV(D114 vector)載體穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中的腫瘤干細胞相關(guān)基因(Oct4／Nanog)、EMT相關(guān)基因(snail／Vimentin／ZEB)及NF-kB靶基因(MMP-9)表達均出現(xiàn)升高,提示這些關(guān)鍵的化療耐藥相關(guān)機制參與了D114／Notch增強胰腺癌化療耐藥的過程；
　　 3.4D114在體外對胰腺癌細胞系促血管生成能力無明顯影響

12、:穩(wěn)轉(zhuǎn)胰腺癌細胞系VEGF分泌量無顯著下降,Real-time PCR發(fā)現(xiàn)D114穩(wěn)定轉(zhuǎn)染胰腺癌細胞系VEGF mRNA表達量無明顯改變；
　　 3.5D114／Notch過度激活可減少胰腺癌組織血液灌注并降低化療藥物灌注:皮下注射構(gòu)建EV(empty vector)及DV(D114 vector)組荷瘤鼠模型,通過DCE-MRI及熒光灌注檢查發(fā)現(xiàn)DV組胰腺癌腫瘤血管生成減少、血液灌注降低,隨后通過Dox灌注發(fā)現(xiàn)DV組胰腺癌化療

13、藥物轉(zhuǎn)運也出現(xiàn)了減少；
　　 3.6體內(nèi)試驗證實D114／Notch通路過度激活可增強胰腺癌化療耐藥性:每周兩次測量移植瘤模型大小變化,并給以吉西他濱(100mg／kg)化療,試驗結(jié)果顯示EV組腫瘤生長速度較DV組明顯減緩,提示吉西他濱化療對DV敏感性下降。
　　 4.研究結(jié)論:
　　 4.1D114及其主要受體(Notch1／4)在部分胰腺癌腫瘤出現(xiàn)了高表達,其中D114的蛋白陽性表達率具有統(tǒng)計學意義；