藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞脂代謝紊亂所產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)保護(hù)性自噬發(fā)生的機(jī)制研究.pdf

1、結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率高居世界惡性腫瘤的第三位，死亡率居第四位。到目前為止，對(duì)于晚期或已經(jīng)發(fā)生侵潤(rùn)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者來(lái)說(shuō)，有效的治療措施很有限，故新的低毒高效的化療藥物開發(fā)及綜合性治療策略制訂顯得尤其重要。藤黃酸是藤黃科植物藤黃樹脂中的主要活性成分，在過(guò)去的半個(gè)世紀(jì)以來(lái)，藥理學(xué)研究已經(jīng)揭示了藤黃酸對(duì)多種腫瘤顯示出了強(qiáng)大的抗腫瘤活性，如白血病、肝癌、頭頸部腫瘤、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、宮頸癌和肺癌等。近年來(lái)，有報(bào)道

2、稱藤黃酸在體內(nèi)、體外均顯示出了對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞顯著的抗癌活性。由于藤黃酸具有廣譜的抗腫瘤作用，且對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞的毒性作用很小，它已經(jīng)被中國(guó)食品和藥物管理局批準(zhǔn)作為廣譜的抗腫瘤藥物進(jìn)行臨床試驗(yàn)，目前Ⅱ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)完成。但是，有關(guān)藤黃酸精細(xì)的抗瘤機(jī)制目前尚不清楚，還有待進(jìn)一步研究。
　　在本課題中，利用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有增殖抑制的作用。利用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藤黃酸主要是通過(guò)caspase-3途徑

3、誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，利用電子顯微鏡可觀察到藤黃酸可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)自噬泡形成；利用吖啶橙染色可觀察到藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)酸性膜泡（Acidic Vesicular Organelles,AVO）的形成；通過(guò)外源性轉(zhuǎn)染GFP-LC3，利用熒光顯微鏡可觀察到結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)自噬斑點(diǎn)聚集現(xiàn)象；利用免疫印跡檢測(cè)到藤黃酸能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，且具有藥物濃度及時(shí)間依賴性；利用免疫印跡檢測(cè)到藤黃酸能誘

4、導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)Atg5-Atg12、Atg7及Beclin1等自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)；通過(guò)鼠源的C26細(xì)胞建立了小鼠皮下移植瘤模型，每次加藥前稱量小鼠體重及測(cè)量皮下瘤體表面積，處死小鼠后取下瘤塊，稱量瘤塊重量，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可獲知藤黃酸具有明顯的抑瘤效應(yīng)；通過(guò)免疫印跡及免疫組化檢測(cè)瘤塊中 Caspase-3及LC3-Ⅱ表達(dá)情況，證實(shí)了藤黃酸同樣可在體內(nèi)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬與凋亡。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明藤黃酸在體內(nèi)、體外都能同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)

5、胞自噬與凋亡發(fā)生。利用3-MA或si-Atg5、si-Beclin1抑制細(xì)胞自噬發(fā)生后，可明顯增強(qiáng)藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖抑制和細(xì)胞凋亡，說(shuō)明細(xì)胞自噬在藤黃酸抗瘤過(guò)程中對(duì)腫瘤細(xì)胞起著保護(hù)性作用。利用DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)到藤黃酸能誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，利用NAC抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生后，通過(guò)外源性轉(zhuǎn)染GFP-LC3，熒光顯微鏡下可觀察到藤黃酸誘導(dǎo)的自噬斑點(diǎn)明顯減少；通過(guò)免疫印跡檢測(cè)到LC3-Ⅱ表達(dá)明顯減少；這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明

6、藤黃酸是通過(guò)引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。通過(guò)蛋白組學(xué)方法—雙向電泳揭示了藤黃酸治療組改變了多種氧化還原蛋白及脂代謝調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)。為了進(jìn)一步闡明藤黃酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS積聚是否與脂代謝紊亂相關(guān)，我們分別通過(guò)特異性抑制NADPH氧化酶（NOX）、線粒體氧化呼吸鏈及LOX來(lái)源的ROS抑制劑，利用DCFH-DA活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)藤黃酸引發(fā)產(chǎn)生的ROS來(lái)源于LOX。利用免疫印跡檢測(cè)p-mTOR、p-Akt及p-P70S

7、6K,證實(shí)藤黃酸是通過(guò)引發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS積聚，抑制Akt-mTOR信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。
　　通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，藤黃酸作為一種抗癌的天然藥物，對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞具有明顯的抑瘤效應(yīng)；另外，藤黃酸還可同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡，且細(xì)胞自噬在藤黃酸抗結(jié)直腸癌過(guò)程中起著保護(hù)性角色，如果在藤黃酸處理結(jié)直腸癌細(xì)胞的過(guò)程中同時(shí)抑制細(xì)胞自噬發(fā)生，藤黃酸的抗瘤效果將會(huì)明顯增強(qiáng)。藤黃酸誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生的分子機(jī)制是：通過(guò)引發(fā)結(jié)

8、直腸癌細(xì)胞內(nèi)脂代謝紊亂而產(chǎn)生過(guò)多ROS，并通過(guò)抑制Akt-mTOR信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生。本課題通過(guò)闡明藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬的分子機(jī)制，為臨床上藤黃酸聯(lián)合細(xì)胞自噬抑制劑協(xié)同抗瘤提供了理論基礎(chǔ)。本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分
　　目的：探討藤黃酸在體內(nèi)外對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的抗癌活性及誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用，闡明藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)其抗癌效果的影響。
　　方法：檢測(cè)藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖抑

9、制效應(yīng)及是否誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡：利用MTT法評(píng)估藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)；利用流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的效果；利用免疫印跡檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡過(guò)程中 caspase-3表達(dá)情況。檢測(cè)藤黃酸是否誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生：利用電鏡檢測(cè)藤黃酸是否誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中自噬膜泡的形成；利用吖啶橙染色檢測(cè)藤黃酸是否誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中酸性膜泡（AVO）形成；利用外源性GFP-LC3轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞

10、中，通過(guò)熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)聚集的自噬斑形成；通過(guò)免疫印跡檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化情況；通過(guò)免疫印跡檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白Atg5-Atg12、Atg7、Beclin1的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)其抗癌效果的影響：利用3-MA或siAtg5、siBeclin1抑制藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，通過(guò) TUNEL檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡情況。通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)藤黃酸的抗瘤效果及是

11、否同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡發(fā)生：建立小鼠皮下瘤模型，通過(guò)每次注射藥物前測(cè)量小鼠體重及瘤塊面積，處死小鼠取下皮下瘤后測(cè)量瘤塊重量，利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析藤黃酸在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的抑瘤效果；利用免疫組化及免疫印跡檢測(cè)caspase-3及LC3-Ⅱ的表達(dá)情況，闡明藤黃酸在體內(nèi)是否誘導(dǎo)細(xì)胞自噬及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
　　結(jié)果：藤黃酸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡：MTT結(jié)果顯示，藤黃酸明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞術(shù)及 TUN

12、EL實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示藤黃酸具有顯著的抗癌效果（誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡）；免疫印跡檢測(cè)顯示，藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡是通過(guò) caspase-3途徑實(shí)現(xiàn)的。藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的發(fā)生：電鏡結(jié)果顯示，藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中自噬膜泡（雙層膜泡，細(xì)胞自噬的形態(tài)學(xué)標(biāo)志物之一）的形成；吖啶橙染色顯示，藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中酸性膜泡（AVO,細(xì)胞自噬的另一形態(tài)學(xué)標(biāo)志物）形成；外源性 LC3轉(zhuǎn)染入結(jié)直腸癌細(xì)胞后，通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到聚集的自噬斑形

13、成；通過(guò)免疫印跡檢測(cè)顯示，藤黃酸可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化（自噬現(xiàn)象發(fā)生的標(biāo)記）。藤黃酸可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬：利用3-MA或siAtg5、siBeclin1抑制藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬后，藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象明顯增強(qiáng)，說(shuō)明藤黃酸誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬拮抗細(xì)胞凋亡。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬和細(xì)胞凋亡：利用結(jié)直腸癌細(xì)胞 C26建立小鼠皮下瘤模型，每次注射藥物前測(cè)量皮下瘤面積及稱量小鼠體重，取瘤后

14、稱量小鼠皮下瘤重量，通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可得出結(jié)論：藤黃酸在體內(nèi)具有明顯的抑制腫瘤細(xì)胞增殖及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用；通過(guò)免疫組化及免疫印跡檢測(cè)證實(shí)藤黃酸在體內(nèi)也可同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬及caspase-3途徑的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：藤黃酸在抗結(jié)直腸癌過(guò)程中誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生保護(hù)性自噬。
　　第二部分
　　目的：闡明藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。
　　方法：利用DCFH-DA ROS檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

15、藤黃酸是否引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS積聚現(xiàn)象；通過(guò)ROS廣譜抑制劑NAC抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，利用外源性轉(zhuǎn)染GFP-LC3入結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)，在熒光顯微鏡下觀察藤黃酸是否誘導(dǎo)胞內(nèi)形成聚集的自噬斑點(diǎn)；通過(guò)ROS廣譜抑制劑NAC抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，利用免疫印跡檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅱ表達(dá)情況；利用蛋白組學(xué)方法—雙向電泳篩選結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)藤黃酸處理組與藤黃酸未處理組之間差異性表達(dá)的蛋白質(zhì)；為了檢測(cè)藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌

16、細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的來(lái)源，分別利用線粒體氧化呼吸鏈、NADPH氧化酶(NOX)及LOX來(lái)源的ROS抑制劑Rot、Apo及NDGA特異性抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)來(lái)源的ROS產(chǎn)生，通過(guò)DCFH-DA ROS檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生情況，通過(guò)免疫印跡檢測(cè)LC3-Ⅱ表達(dá)情況；利用免疫印跡檢測(cè)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR及p-70S6K的表達(dá)情況，以便闡明藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞自噬的分子機(jī)制。<

17、br>　　結(jié)果：藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS：通過(guò)熒光顯微鏡及分光光度法可以檢測(cè)到藤黃酸能明顯誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞產(chǎn)生ROS積聚。藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生：通過(guò)ROS廣譜抑制劑NAC抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生后，利用外源性GFP-LC3轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細(xì)胞，熒光顯微鏡下可發(fā)現(xiàn)藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)自噬斑形成明顯減少；利用免疫印跡檢測(cè)到藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化形成的LC3Ⅱ明顯減少；以上結(jié)果說(shuō)明藤黃酸誘導(dǎo)產(chǎn)

18、生的細(xì)胞自噬與藤黃酸引發(fā)胞內(nèi)ROS集聚密切相關(guān)。藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS可能與氧化還原反應(yīng)及脂代謝紊亂相關(guān)：雙向電泳檢測(cè)到藤黃酸處理組與藤黃酸未處理組之間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，通過(guò)質(zhì)譜分析并進(jìn)行亞細(xì)胞定位或生物學(xué)功能進(jìn)行分類，其中氧化還原調(diào)節(jié)蛋白占25％，與脂代謝相關(guān)蛋白占17％，雙向電泳及質(zhì)譜分析所得的結(jié)果提示藤黃酸可能引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)及脂代謝紊亂，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS可能與脂代謝紊亂相關(guān)。藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞產(chǎn)

19、生的ROS來(lái)源于LOX:利用線粒體氧化呼吸鏈、NADPH氧化酶及LOX來(lái)源的ROS抑制劑Rot、Apo及NDGA特異性抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)相關(guān)來(lái)源的ROS產(chǎn)生后，通過(guò)使用DCFH-DA ROS檢測(cè)試劑盒，可檢測(cè)到LOX抑制劑NDGA可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生；免疫印跡結(jié)果表明NDGA可明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，說(shuō)明ROS產(chǎn)生的來(lái)源是LOX。藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS通過(guò)抑制Akt-mTOR信號(hào)通路

20、而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生：免疫印跡檢測(cè)到藤黃酸處理過(guò)的結(jié)直腸癌細(xì)胞中p-Akt、p-mTOR及p-70S6K的表達(dá)明顯明顯降低，且具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性，說(shuō)明藤黃酸是通過(guò)抑制PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生；通過(guò)ROS廣譜抑制劑NAC或LOX抑制劑NDGA分別抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，均可導(dǎo)致p-Akt、p-mTOR及p-P70S6K的表達(dá)明顯增強(qiáng)，說(shuō)明藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ROS積聚可抑制PI3K-Akt-mT