建立葡萄糖二酸及其1,4內(nèi)酯檢測(cè)新方法及其抗炎作用的代謝組學(xué)初步研究.pdf

1、本研究前期工作發(fā)現(xiàn)了中藥六味地黃丸(LWPs)中含有葡萄糖二酸鹽。大量的藥理實(shí)驗(yàn)研究表明葡萄糖二酸鹽具有包括抗癌等廣泛的藥理作用。因此,本論文應(yīng)用高效液相紫外檢測(cè)器(UV)、蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)和質(zhì)譜檢測(cè)器(MS)建立了六味地黃丸中葡萄糖二酸(GA)及其1,4內(nèi)酯(1,4-GL)的含量測(cè)定方法,并研究了葡萄糖二酸及其1,4內(nèi)酯在體內(nèi)外的相互轉(zhuǎn)化。在此基礎(chǔ)上利用基于核磁共振(1H NMR)技術(shù)的代謝組學(xué)方法初步研究了葡萄糖二酸及其1,

2、4內(nèi)酯體內(nèi)抗炎的代謝機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:
　　1.六味地黃丸中葡萄糖二酸及其(或)1,4內(nèi)酯含量測(cè)定新方法的建立。
　　1)、建立了六味地黃丸中葡萄糖二酸及其1,4內(nèi)酯的高效液相色譜親水紫外(HPLC-HILIC-UV)檢測(cè)方法。六味地黃丸經(jīng)20％的甲醇溶液超聲提取后,用色譜柱HILIC色譜柱,以乙腈-5mM磷酸二氫銨+0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相,梯度洗脫;柱溫35℃;流速0.8ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng)205nm;進(jìn)樣10μ

3、l。結(jié)果表明GA濃度在25-400μg/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:A=0.0848C+0.6958 r=0.9993(n=5)。1,4-GL濃度在25-400μg/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:A=0.1430C+0.5917 r=0.9996(n=5)。研究結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好、結(jié)果穩(wěn)定。六味地黃丸水蜜丸中 GA的含量為7.10±3.2mg/g、1,4-GL為3.96±1

4、.6 mg/g,濃縮丸中 GA為15.60±4.8mg/g、1,4-GL為8.34±4.3mg/g。
　　2)、建立了六味地黃丸中葡萄糖二酸高效液相色譜親水蒸發(fā)光( HPLC-HILIC-ELSD)檢測(cè)方法。六味地黃丸經(jīng)20%的甲醇溶液超聲提取后,用色譜柱HILIC色譜柱;以乙腈-20mM醋酸胺,0--5min(80:20),5--25min(80:20--75:25),25--30min(75:25--50:50),30--35

5、min(50:50--80:20),35--45min(80:20)為流動(dòng)相梯度洗脫;流速0.8ml/min;柱溫35℃;進(jìn)樣10μl;漂移管溫度60℃;氣流1.2 L/min。結(jié)果表明葡萄糖二酸濃度在50-400μg/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:A=0.5882C-7.0275 r=0.9991(n=6)。研究結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、結(jié)果穩(wěn)定。六味地黃丸水蜜丸中GA含量為8.18±2.4 mg/g、

6、濃縮丸中為19.52±3.8 mg/g。
　　3)、建立了六味地黃丸中葡萄糖二酸1,4內(nèi)酯超高液相色譜質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)的檢測(cè)方法。六味地黃丸經(jīng)20%甲醇超聲提取后,用Waters BEH C18色譜柱,柱溫:40℃。流動(dòng)相:10mM甲酸-乙腈(90:10);流速0.4ml/min,用UPLC-MS/MS檢測(cè)。結(jié)果表明1,4-GL濃度在0.83-830μg/ml內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程為:A=12.771

7、C+15.47 r=0.9990(n=5)。研究結(jié)果表明該方法專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、結(jié)果穩(wěn)定。六味地黃丸水蜜丸中1,4-GL含量為4.03±3.1 mg/g、濃縮丸為8.69±2.9 mg/g。
　　以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所建立的葡萄糖二酸及其(或)1,4內(nèi)酯檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠,可用于六味地黃丸中葡萄糖二酸及其(或)1,4內(nèi)酯含量的定量分析。
　　2、探討了GA和1,4-GL在體內(nèi)外相互轉(zhuǎn)化的規(guī)律。分別在室溫條件下采用了pH為1

8、.0、3.0、7.0、10.0、12.0,1,4-GL向GA的轉(zhuǎn)變;溫度為37℃、100℃不同pH(1.0、3.0、7.0)條件下GA向1,4-GL的轉(zhuǎn)變。結(jié)果表明在室溫、堿性條件下(pH=12.0),1,4-GL立刻完全轉(zhuǎn)變?yōu)?GA;在水溶液中室溫條件下 GA向1,4-GL轉(zhuǎn)化平衡需要兩周以上,但在酸性條件(pH=1.0)和100℃條件下,GA向1,4-GL的轉(zhuǎn)化較快(小于30min)和具有較高的轉(zhuǎn)化率(33.3%);同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)在

9、給大鼠灌胃GA后,GA在胃內(nèi)并沒有迅速轉(zhuǎn)化為1,4-GL,只是少量轉(zhuǎn)化為1,4-GL(小于5%)左右。提示要充分發(fā)揮葡萄糖二酸衍生物的藥理作用,應(yīng)在體外使GA轉(zhuǎn)化為1,4-GL。
　　3、葡萄糖二酸及其1,4內(nèi)酯對(duì)大鼠炎癥作用的代謝組學(xué)研究。應(yīng)用1H NMR技術(shù)結(jié)合主成分分析方法(PCA),研究角叉菜膠誘導(dǎo)大鼠炎癥模型、正常組及給藥組尿液、腎臟組織、肝臟組織、血液成分圖譜的差異。結(jié)果顯示正常組和炎癥組具有不同的代謝表型,經(jīng)正交偏最

10、小方差判別分析(OPLS-DA)確定了引起代謝表型差異的相關(guān)特征代謝物。如血液中丙酮酸、3-羥基丁酸、乳酸、肌酐水平上升;尿液中乳酸、丙氨酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸、甘氨酸、尿苷水平上升,馬尿酸、尿囊素、肌酐水平降低;腎臟中醋酸水平上升,尿囊素水平降低;肝臟中各代謝物水平?jīng)]有明顯的代謝差異。同時(shí)發(fā)現(xiàn)大鼠給 GA和1,4-GL混合物后大鼠足趾的腫脹度得到了明顯的抑制,說明GA和1,4-GL對(duì)炎癥具有一定的抑制作用。通過代謝組學(xué)研究結(jié)果顯示,