眼發(fā)育相關基因CRX及SIX家族成員的蛋白特性分析.pdf

1、隨著社會的進步，遺傳性疾病的發(fā)病率逐年升高，并且絕大多數(shù)遺傳病很難根治，多數(shù)遺傳性疾病又與個體的發(fā)育直接或間接相關，所以闡明其發(fā)病機制對防治遺傳性疾病有重要的指導意義和潛在的應用價值。本研究通過了解眼發(fā)育相關基因CRX(Cone-rod Homeobox)及SIX(Sine Oculis Homeobox Homolog)家族成員(SIX1,SIX3,SIX6)蛋白的特性，探索它們在遺傳性眼疾發(fā)生發(fā)展中的作用，主要應用蛋白復合體免疫沉淀

2、(protein complex pull-down)等分子生物學技術，尋找與CRX蛋白發(fā)生相互作用的蛋白分子，并了解眼發(fā)育相關基因SIX家族成員對發(fā)育分化的影響，為后續(xù)進一步分析這類遺傳性疾病的致病機制奠定基礎。
　　 1.CRX蛋白復合物成員的分析
　　 目的：分離純化CRX蛋白復合體的其他蛋白成分，了解CRX蛋白參與的信號通路。方法：將CRX基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pOZFHN-puro上，通過在293T細胞中的瞬

3、時表達來鑒定其載體；制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染RB50細胞，通過嘌呤霉素篩選，再挑取單克隆細胞；western blotting檢測CRX的表達，大量培養(yǎng)其陽性克隆細胞，制備其核提取物，通過免疫沉淀法純化CRX蛋白復合體，最后在梯度凝膠中分離其蛋白復合體成員并質(zhì)譜測序分析。
　　 結(jié)果：通過質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)了CRX蛋白能免疫沉淀32種蛋白，其中有7種熱激蛋白、5種解旋酶、5種翻譯因子、4種RNA加工因子、3種核糖核蛋白、2種蛋白激酶、2

4、種血影蛋白、2種組蛋白及2種ATP合成酶。
　　 結(jié)論：CRX蛋白能免疫沉淀32種以前未見報道的蛋白，表明CRX通過一個更復雜的信號通路參與到視網(wǎng)膜的發(fā)育。
　　 2.SIX家族蛋白對發(fā)育分化的影響(Six1基因?qū)2C12細胞分化的影響)
　　 目的：了解外源性Six1基因的表達對C2C12細胞分化的影響。
　　 方法：將Six1基因克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pOZFHN-puro上，通過在293T細胞中的瞬

5、時表達來鑒定其載體。制備逆轉(zhuǎn)錄病毒，感染C2C12細胞，通過嘌呤霉素的篩選得到陽性細胞；應用細胞計數(shù)、luciferase分析和western blotting等方法，來分析Six1對C2C12細胞增值與分化的影響。
　　 結(jié)果：外源Six1基因的表達不改變C2C12細胞的增值和p21的表達，也不影響MEF2的表達，但能通過抑制Myogenin及Myosin的表達來延遲(非抑制)C2C12細胞的分化。
　　 結(jié)論：Six