制首烏對疊氮鈉腦內(nèi)灌流大鼠的腦保護機制研究.pdf

1、本研究中選用已證實有效的劑量的制首烏水煎液進行研究。旨在探討制首烏對疊氮鈉灌流所致的大鼠腦內(nèi)乙酰膽堿水平下降的調(diào)節(jié)作用及其機理。為何首烏作為腦保護劑治療老年人常見的退行性疾病所致的癡呆提供實驗依據(jù)。 研究方法：微透析技術(shù)動態(tài)監(jiān)測腦內(nèi)Ach/Ch水平變化：微透析技術(shù)是利用小分子物質(zhì)能通過半透膜順濃度梯度進行擴散的原理為基礎(chǔ)進行腦內(nèi)采樣的技術(shù)。本研究采用此方法實現(xiàn)對清醒自由活動大鼠腦內(nèi)細胞外Ach/Ch水平變化的動態(tài)監(jiān)測；高效液相色

2、譜-柱后固定化酶反應(yīng)器-電化學(xué)檢測法測定微透析透析液中乙酰膽堿和膽堿含量：本研究參考BAS公司ACh/Ch測試操作手冊(MF-9053)和文獻報道的方法，對微透析收集的透析液進行Ach/Ch含量的測定。方法學(xué)考察顯示，該方法測定Ach和Ch靈敏可靠；放射性同位素結(jié)合法測定膽堿乙?；?ChAT)活力；分光光度法測定膽堿酯酶(AchE)活力；放射性配基-受體結(jié)合法測定膽堿能M受體及NMDA受體結(jié)合力；分光光度法測定乳酸(LD)含量。

3、 研究內(nèi)容：腦內(nèi)灌流NaN3120min造成膽堿能神經(jīng)損傷的模型研究。 研究指標：透析液中的Ach和Ch含量；灌流結(jié)束后斷頭處死動物并取出灌流測紋狀體，測定ChAT、AchE、M受體、NMDA受體活性以及LD含量。 數(shù)據(jù)處理：兩組各指標數(shù)據(jù)以均值±標準差(Mean±Sd)表示，均值比較用t檢驗。 結(jié)果：Ach水平變化：對照組在整個觀察期間，紋狀體Ach水平基本穩(wěn)定，偶有波動。模型組在灌流NaN3期間，Ach水平顯著

4、下降；在停灌NaN3后Ach水平停止下降，5.5h之后呈現(xiàn)基本穩(wěn)定、緩慢上升的趨勢，至14.5h的時候，已經(jīng)上升到和對照組比較差異無顯著性意義的水平；Ch水平的變化：對照組在整個灌流期間Ch水平基本上很穩(wěn)定。模型組在開始灌流NaN3之后Ch水平就開始急劇上升，在lh時達到高峰，之后處于平臺期；在停止灌流NaN3之后，Ch水平即開始下降，從第4h開始就基本穩(wěn)定下來；其他指標的變化：在停灌NaN3后16.5h，模型組紋狀體ChAT活性和膽堿

5、能M受體活性和對照組比有所降低，但差異無顯著性意義。AchE活性和乳酸含量兩組間很接近。模型組的NMDA受體活性顯著升高。 討論：通過測定腦內(nèi)ACh的含量可以較可靠的反映腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)的功能。本試驗結(jié)果顯示0.2％的NaN3灌流液120min腦內(nèi)微透析灌流使得紋狀體Ach水平下降，并且這種變化是可逆性的，在停止灌流后14.5小時即恢復(fù)到正常水平。因此，大鼠膽堿能神經(jīng)功能下降的造模是成功的。　　對于神經(jīng)遞質(zhì)的研究，不僅僅只有對遞

6、質(zhì)本身含量變化的研究，還應(yīng)該對其受體以及代謝酶作分析，才能比較全面地把握遞質(zhì)系統(tǒng)的改變。本試驗結(jié)果未能發(fā)現(xiàn)ChAT、AchE以及M受體活性的改變。乳酸的堆積能反映細胞線粒體功能障礙，本實驗未能發(fā)現(xiàn)LD含量的明顯變化。這些陰性試驗結(jié)果均可能與時程有關(guān)，即在停灌NaN3后16.5h，這些變化已經(jīng)明顯減輕乃至消失?！　MDA受體被過度激活，引發(fā)興奮性氨基酸毒性，在AD等神經(jīng)疾病的發(fā)病機制中扮演重要角色，本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)NaN3能造成NMDA

7、活性的顯著升高。 小結(jié)：此部分的試驗全程觀察了腦內(nèi)灌流0.2％NaN3120min及之后恢復(fù)期的紋狀體Ach和Ch水平的動態(tài)變化。試驗結(jié)果顯示Ach水平的可逆性下降以及Ch水平的可逆行升高，提示NaN3造成膽堿能神經(jīng)功能下降的動物模型成功；其它各指標陰性結(jié)果提示在停灌NaN3后16.5h，損傷可能已經(jīng)基本恢復(fù)。結(jié)合Ach和Ch的動態(tài)變化情況，擬在下面的藥效及機制研究中，于停灌NaN3后3.5h處死動物取紋狀體，以期觀察到腦內(nèi)相關(guān)

8、指標的變化。 本文研究了制首烏對腦內(nèi)灌流NaN3大鼠的腦保護作用及其機制。 動物分組與處理：SD大鼠被隨機分為5組：制首烏組(15g/Kg)、都可喜組(10mg/Kg)、制首烏+都可喜組(制首烏15g/Kg+10mg/Kg都可喜)，對照組與模型組(給予等體積蒸餾水)。連續(xù)灌胃給藥14天，于第13天做探陣套管埋植手術(shù)，第二天動物清醒后插入探針進行微透析。　　微透析方案：探針植入紋狀體中，收集NaN3灌流前、灌流中(2h)

9、、灌流后(恢復(fù)期，3.5h)的透析液，每30分鐘收集一管。 研究指標：透析液中的Ach和Ch含量，二者各自的濃度-時間曲線下面積、極值、極值對應(yīng)時間；灌流結(jié)束后斷頭處死動物并取出灌流測紋狀體，測定ChAT、AchE、M受體、NMDA受體活性以及LD含量。 結(jié)果：Ach水平的變化：對照組Ach水平在觀察期間基本保持穩(wěn)定，模型組在灌流NaN3期間Ach水平明顯下降；在停止灌流NaN3之后不再繼續(xù)下降，但一直顯著低于對照組。這

10、個結(jié)果和前面進行的造模試驗結(jié)果基本一致。在整個觀察期間，各給藥組紋狀體細胞外Ach水平一直高于模型組，其中有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義的時間點在制首烏組和都可喜組各有2個，制首烏+都可喜合用組有7個。三給藥組之間比較，各時間點數(shù)據(jù)差異均無顯著性意義。　　和對照組比較，模型組的Ach濃度-時間曲線下面積、Ach最小值均顯著低于對照組，各給藥組和模型組比較，均有升高。但給藥組的Ach最小值對應(yīng)時間和模型組大致相同?！　h水平的變化：開始灌流Na

11、N3后，模型組大鼠紋狀體細胞外中Ch含量開始出現(xiàn)顯著升高；在停止灌流NaN3后，Ch水平開始下降，直到停灌3h時恢復(fù)到和對照組無明顯差異的水平。在整個觀察期間，各給藥組紋狀體細胞外Ch水平一直低于模型組，其中數(shù)據(jù)差異有顯著性意義的時間點在制首烏組有3個，都可喜組有6個，制首烏+都可喜合用組有1個。三給藥組之間比較，差異均不具有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義，模型組Ch的濃度-時間曲線下面積和Ch最大值均顯著高于對照組，各給藥組和模型組比較均有降低。各

12、組之間的Ch最大值對應(yīng)時間均大致相同?！　hAT活性變化：模型組ChAT活性明顯低于對照組，各給藥組ChAT活性均明顯高于模型組?！　chE活性的變化：各組AchE話性相差不大。　　M受體活性變化：模型組比對照組有所下降，但沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義。和模型組比較，都可喜組和制首烏+都可喜合用組均明顯升高。　　NMDA受體活性變化：模型組比對照組有所升高，但差異不具顯著性意義。與模型組比較，各給藥組均能顯著降低NMDA受體結(jié)合力。

13、　　LD含量變化：各組的乳酸含量相差不大。 討論：以上結(jié)果提示腦內(nèi)灌流NaN3120min，紋狀體的細胞外Ach水平有顯著下降而Ch水平顯著上升，與前面的造模試驗基本一致，表明模型重復(fù)成功。　　三個給藥組均可不同程度地改善NaN3引起的Ach水平下降，但是制首烏和都可喜主要在灌流NaN3期間顯示這種效果，而二藥合用則在恢復(fù)期也有明顯的改善效果。并且這種改善作用基本上體現(xiàn)在降低這種下降的程度，而不是延遲這種下降。各給藥組均可減

14、輕Ch堆積，提示其改善Ach水平的作用可能與其改善Ch的攝取有關(guān)?！　⊥９郚aN3后的3.5h時模型組ChAT活性降低，其機制可能與NaN3造成線粒體功能障礙、導(dǎo)致細胞功能受損，波及胞體內(nèi)的ChAT有關(guān)。這個結(jié)果和Ach水平的變化一致，提示NaN3使腦內(nèi)Ach水平下降，與NaN3造成ChAT活性下降有關(guān)；而各給藥組可以提高ChAT活性，提示其改善學(xué)習(xí)記憶的功能與其提高ChAT活性，促進Ach合成有關(guān)?！　chE活性變化的結(jié)果并不能

15、確切說明NaN3對AchE活性沒有影響，而可能是因為灌流液中含有新斯的明(AchE的可逆性抑制劑)，導(dǎo)致AchE變化被“抹煞”了。　　都可喜和制首烏+都可喜合用均可增高M受體活性，從而改善膽堿能神經(jīng)功能。達到腦保護、改善學(xué)習(xí)記憶功能的作用。　　在停灌NaN3之后的3.5h，模型組NMDA受體較對照組升高，但沒有統(tǒng)計學(xué)顯著性意義，提示在這個時刻NaN3造成的影響還沒有太深，可能跟興奮性氨基酸在細胞損傷到一定程度之后才會過度釋放有關(guān)。但

16、是各給藥組在此時已經(jīng)顯示出其抗興奮性氨基酸過度釋放的效果，推測它們提高腦內(nèi)Ach水平的作用與其抗興奮性氨基酸毒性、保護腦細胞有關(guān)。　　研究結(jié)論：0.2％NaN3腦內(nèi)灌流120min可以導(dǎo)致腦內(nèi)Ach水平下降，其機制可能與Ch攝取障礙引起Ach合成原料減少、ChAT活性降低致Ach合成減少有關(guān)；而ChAT活性下降可能與興奮性氨基酸過度釋放導(dǎo)致細胞損傷以及NaN3直接導(dǎo)致細胞內(nèi)能量代謝障礙從而影響ChAT活性有關(guān)。這些結(jié)果表明NaN3可以

17、導(dǎo)致膽堿能神經(jīng)功能障礙?！　≈剖诪跛嵋?15g/Kg)可以通過改善NaN3腦內(nèi)灌流模型大鼠的膽堿能神經(jīng)功能來達到腦保護的效果，其機制為提高腦內(nèi)Ach水平，增強M受體活性，改善膽堿能神經(jīng)功能；提高Ach水平的作用與其提高ChAT活性、改善Ch的攝取有關(guān)；減輕NMDA受體過度激活，降低興奮性氨基酸毒性，保護細胞，從而改善Ch攝取和ChAT活性。以上制首烏的作用與都可喜(10mg/Kg)相似，二藥合用效果較單用為好。　　本研究首次對0.