XRCC6、XRCC5多態(tài)性與中國安陽地區(qū)食管鱗癌發(fā)生風(fēng)險關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、研究背景：
　　食管癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其導(dǎo)致的死亡率居第七位。食管癌主要分為食管鱗癌和食管腺癌，兩者發(fā)病都呈現(xiàn)出區(qū)域性。中國食管癌中90％-95％為食管鱗癌，而食管腺癌發(fā)病率相對較低。在我國北方，河南省、山東省、河北省交界處，尤其是河南安陽地區(qū)，食管鱗癌發(fā)病率明顯高于其他地方。針對這一特點，目前研究集中在當(dāng)?shù)匚⒘吭?、飲食?xí)慣、微生物等方面。通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)在上述高發(fā)地區(qū)，食管鱗癌的發(fā)生呈明顯的家族性發(fā)

2、病，這表明在這些地方，食管鱗癌的發(fā)生可能有遺傳性因素參與。在各種環(huán)境致癌因素作用下，個體基因組發(fā)生突變，累積到一定程度，影響到基因組的穩(wěn)定性，導(dǎo)致機體發(fā)生病理改變，最終引起腫瘤的發(fā)生。因此在腫瘤發(fā)生過程中，個體遺傳基因是起到?jīng)Q定性作用的“內(nèi)因”，而環(huán)境致癌因素是促進腫瘤發(fā)生的“外因”。環(huán)境因素作用下，個體基因組的單核苷酸多態(tài)性之間相互作用，最終導(dǎo)致某些疾病的發(fā)生。單倍型就是體現(xiàn)了個體基因組內(nèi)單核苷酸多態(tài)性之間的相互聯(lián)系。單核苷酸多態(tài)性(

3、SNP)可能直接影響基因的功能，或是與潛在的致病位點存在關(guān)聯(lián)，這一特點使其與基因突變并列，成為遺傳學(xué)研究的主要抓手。同一條染色體上連鎖的SNP位點同時遺傳給后代的可能性較大，這即是所謂的“單倍型方式遺傳”。相對于雜合度低，攜帶信息少的SNP，單倍型分析能提供更多的信息。因此單倍體型分析聯(lián)合SNP分析，能更好的揭示遺傳因素在疾病發(fā)生、發(fā)展過程中所起的作用。
　　既往流行病學(xué)研究認(rèn)為環(huán)境致癌因素是食管鱗癌發(fā)病的主要病因，而最近分子流行

4、病學(xué)研究表明，環(huán)境致癌因素和基因遺傳因素都是食管鱗癌的主要致病因素。隨著生物科學(xué)技術(shù)的進步，人類基因組流行病學(xué)(Human genomeepidemiology， HuGE)逐漸成熟并成為研究熱點，它采用流行病學(xué)的方法對大樣本的人群進行調(diào)查，目的是發(fā)現(xiàn)影響人類健康和疾病的遺傳變異，它是在人類基因組測序完成之后才出現(xiàn)的，是基因技術(shù)在流行病學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用，特別是特別是將DNA微陣列芯片技術(shù)用于全基因組關(guān)聯(lián)研究，可以用來比較病例組和對照組基

5、因組DNA中成千上萬SNP的差別。
　　現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)數(shù)量眾多的SNP可能與食管鱗癌發(fā)病有關(guān)。這其中有關(guān)DNA損傷修復(fù)路徑的基因突變被發(fā)現(xiàn)與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)在維護基因組DNA的穩(wěn)定性及預(yù)防腫瘤的發(fā)生中起著重要的作用。無論是活化的氧自由基等內(nèi)源性損傷還是紫外線照射等外源性的損傷，都會造成基因組DNA損傷，這些損傷一旦發(fā)生，要么導(dǎo)致細(xì)胞癌變，要么導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。的DNA雙鏈斷裂(DSB)是DNA損傷中最嚴(yán)重的一

6、種，而DNA同源修復(fù)(HR)和非同源末端修復(fù)通路(NHEJ pathway)是真核生物修復(fù)DSB的兩種主要形式。同源修復(fù)和非同源修復(fù)主要區(qū)別在于非同源修復(fù)DSB時不需要依賴同源序列就直接把DNA兩個斷端連接起來。NHEJ主要包含XRCC4（人類x-射線修復(fù)交叉互補4基因，又名結(jié)合蛋白Ku80）、XRCC5（人類x-射線修復(fù)交叉互補5基因）、XRCC6（人類x-射線修復(fù)交叉互補6基因，又名結(jié)合蛋白Ku70）、XRCC7（人類x-射線修復(fù)交

7、叉互補7基因）和XLF（人類x-射線修復(fù)交叉互補4基因相似因子）、LIG4（DNA連接酶4）等基因及其蛋白質(zhì)產(chǎn)物。NHEJ修復(fù)過程是DNA發(fā)生DSB后誘導(dǎo)結(jié)合蛋白Ku和XRCC7結(jié)合到DSB末端，形成DNA-PK(DNA依賴蛋白連接酶)，被XRCC5/XRCC6二聚體識別。然后根據(jù)DSB不同類型和復(fù)雜程度，DNA末端被不同的因子（如DNA聚合酶、核糖核酸激酶、MRN復(fù)合體）加工處理。繼而XRCC7從DSB末端游離，最后XLF刺激XRCC

8、4/LIG4復(fù)合體連接DNA末端，從而完成對DSB的修復(fù)。DNA-PK是由XRCC7和XRCC5/XRCC6亞單元組成，這其中XRCC5/XRCC6亞單元起到催化劑和調(diào)控單元的作用。由此可見XRCC5/XRCC6二聚體對于DNA的NHEJ修復(fù)途徑是必須的關(guān)鍵因子，他們一旦發(fā)生突變，即可導(dǎo)致DNA修復(fù)機制障礙，使DNA損傷持續(xù)存在，進而破壞細(xì)胞周期的調(diào)控和監(jiān)測機制，導(dǎo)致細(xì)胞過度增殖或是逃避凋亡。哺乳動物都是由一個受精卵發(fā)育而來，受精卵在分

9、化、增殖過程中要經(jīng)歷成千上萬次內(nèi)源性或是外源性的DNA損傷。這些損傷如果就不能得到有效修復(fù)，這些損傷就會積累下來，導(dǎo)致細(xì)胞基因組不穩(wěn)定性增加，進而導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，其結(jié)局是要么終止，要么畸胎。因此存活下來的健康的個體必需有正常功能的DNA損傷修復(fù)機制。正是由于NHEJ相關(guān)基因嚴(yán)重缺陷可以導(dǎo)致機體生命終結(jié)這樣的嚴(yán)重后果，因此只有細(xì)微的變化比如亞等位基因突變或是多態(tài)性變異才能使細(xì)胞躲過細(xì)胞周期關(guān)卡的監(jiān)督生存下來。而這些存活下來的細(xì)胞的NHE

10、J存在細(xì)微功能缺陷，不能完整修復(fù)DNA損傷，導(dǎo)致DNA損傷累積到足夠引起基因組改變，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
　　本研究所涉及的兩個基因XRCC6和XRCC5就是NHEJ通路的重要組成部分，其基因多態(tài)性及所造成的不同單倍型可能與食管鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　目的：
　　探討XRCC6、XRCC5基因的多態(tài)性，及其所構(gòu)建的不同單倍型與河南省安陽地區(qū)食管鱗癌易感性的關(guān)系。
　　方法：
　　分別提取189例安陽地區(qū)健康

11、對照者和189例食管癌患者的外周血DNA，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性法檢測上述人員外周血基因組DNA中XRCC6 rs2267437和XRCCC5 rs3835 rs16855458位點基因型，在進行酶切反應(yīng)后，從酶切結(jié)果確定的各基因型中選擇10個樣本的PCR擴增原液樣品采用DNA測序的方法明確目標(biāo)基因片段的堿基順序，兩種檢測結(jié)果相互印證，以證明RFLP結(jié)果的可靠性。將兩組人群檢測的基因型采用x2檢驗，發(fā)現(xiàn)其頻率分布符合Ha

12、rdy-Weinberg平衡定律，以條件單變量Logistic回歸法篩選出有顯著差異的人口學(xué)危險因素及備選基因多態(tài)性位點，納入條件多變量Logistic回歸模型計算相對危險度比值比(odds ratio，OR)和95％可信區(qū)間(confidence interval，CI)。采用Phase2.1軟件構(gòu)建、分析單倍型。
　　結(jié)果：
　　在XRCC6 rs2267437和XRCCC5 rs3835 rs16855458這三個位點

13、均發(fā)現(xiàn)基因多態(tài)性。其基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)。攜帶XRCC6 rs2267437等位基因G可增加食管鱗癌發(fā)病風(fēng)險(p=0.003，OR=1.868，95％CI=1.230-2.836)，CG基因型可增加個體食管鱗癌易感性(p=0.001，OR=2.040，95％ CI=1.323-3.147);雖然XRCC5基因多態(tài)性在兩組間的分布無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，但是XRCC5構(gòu)建的單倍型A

14、T/--、CC/--可以增加食管鱗癌發(fā)病風(fēng)險(p=0.01, OR=4.28,95％CI=1.40-13.05;p=0.03,OR=2.31,95％CI=1.11-4.80,respectively)。且吸煙、飲酒與基因多態(tài)性位點之間及各基因多態(tài)性位點之間不存在交互作用(P＞0.05)。
　　結(jié)論：
　　攜帶XRCC6 rs2267437等位基因G以及攜帶CG基因型，可能是食管鱗癌發(fā)生的危險因素。XRCC5的單倍型AT/--