功能性Pluronic P123-F127混合膠束用于治療多藥耐藥腫瘤的研究.pdf

1、腫瘤多藥耐藥(Multidrug resistance,MDR)是臨床上化療失敗的主要原因之一。迄今,許多抗腫瘤藥物如紫杉烷類、長春堿類和蒽醌類等,在臨床上都出現(xiàn)了多藥耐藥性。從藥物傳遞系統(tǒng)的角度研究逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR是治療多藥耐藥腫瘤的一種新思路。本文以Pluronie聚合物膠束和紫杉醇(PTX)作為研究對象,旨在制備一種新型紫杉醇給藥系統(tǒng),既能增溶疏水性的抗腫瘤藥物紫杉醇,同時又具有逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的能力,以解決紫杉醇臨床應(yīng)用的兩大問題:

2、水難溶性與耐藥性,為探索逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的新途徑提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。
　　本文的主要內(nèi)容包括如下四個部分:
　　(1)載紫杉醇Pluronie P123/F127混合膠束的制備與表征;
　　(2)載紫杉醇Pluronic P123/F127混合膠束用于治療肺多藥耐藥腫瘤和肺轉(zhuǎn)移腫瘤的體內(nèi)外評價;
　　(3)Pluronic P123/F127逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥機制的探討;
　　(4)葉酸修飾的載紫杉醇P

3、luronic P123/F127混合膠束于治療多藥耐藥腫瘤的體內(nèi)外評價。
　　首先,采用薄膜水化法制備了載紫杉醇(PTX)Pluronie P123/F127混合膠束(PF-PTX)。在單因素考察基礎(chǔ)上,以包封率、載藥量和膠束穩(wěn)定性為指標,應(yīng)用Doehlert矩陣設(shè)計(Doehlert Matrix Design,DMD)-渴求函數(shù)(Desirability Function)法進行優(yōu)化,得到最優(yōu)處方與制備工藝。按最優(yōu)處方制各的

4、PF-PTX經(jīng)理化性質(zhì)表征可得:PF-PTX的粒徑約為25nm;包封率大于90％;與Taxol相比釋藥速度顯著減慢,具有一定的緩釋作用;經(jīng)1HNMR和FT-IR圖譜驗證PTX被成功包載于膠束的疏水核心;P1uronic P123/F127(2:1,w/w)的CMC值較低,為0.0059％;處方中Pluronic F127的引入顯著增強了膠束體系的穩(wěn)定性。
　　其次,以肺耐藥相關(guān)蛋白過度表達的A.549細胞為肺耐藥細胞模型,進行了細

5、胞毒、細胞攝取、細胞凋亡和細胞周期等細胞水平實驗。結(jié)果表明Pluronic P123/F127可與PTX協(xié)同作用,通過耗竭細胞內(nèi).ATP和降低線粒體跨膜電勢等途徑增加PTX的攝取量,從而促進耐藥細胞的晚期凋亡、增強PTX在G2/M期的捕獲能力和細胞毒作用,故具有一定逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的能力。荷瘤小鼠組織分布研究結(jié)果表明,對于肝和脾中PTX的蓄積量,PF-PTX組顯著低于Taxol組(P＜0.05);而對于在血和腫瘤中PTX的分布,PF-PT

6、X亦顯著高于對照組(P＜0.05),可見PF-PTX的PEO鏈可有效減少血漿蛋白的吸附以及肝、脾等MPS系統(tǒng)的吞噬。另外,在肺和腎臟中,:PF-PTX的蓄積量顯著高于Taxol組(P＜0.01),提示PF-PTX可能是一種理想的治療肺多藥耐藥腫瘤的藥物傳遞系統(tǒng);應(yīng)用小鼠皮下腫瘤模型和肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型對PF-PTX進行了藥效學(xué)評價,結(jié)果表明與Taxol組相比,PF-PTX組具有明顯地控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用,顯著延長荷瘤小鼠的生存期,且沒有

7、明顯的毒副作用。
　　第三,以耐阿霉素人乳腺癌細胞(NCI/ADR-RES)為細胞模型,以4種溶解性不同但均為P-gp的經(jīng)典底物一羅丹明-123(R-123)、羅丹明-6G(R-6G)、鹽酸阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)為P-gp分子探針,考察了不同濃度的Pluronic P123/F127(2:1,w/w)對4種探針在細胞內(nèi)蓄積的影響,結(jié)果表明Pluronic P123/F127對疏水性或親水性的P-gp底物均具有逆轉(zhuǎn)活性,

8、且當(dāng)Pluronic P123/F127濃度大于CMC值時,其逆轉(zhuǎn)能力與載體材料的濃度無關(guān),分子探針被膠束增溶是導(dǎo)致分子探針在胞內(nèi)蓄積量減少的主要原因。另外,實驗表明耗竭耐藥細胞內(nèi)的ATP是Pluronic P123/F127逆轉(zhuǎn)MDR的重要機制;Pluronic P123/F127可作用于線粒體并顯著降低線粒體的跨膜電勢,故可能存在通過線粒體途徑對凋亡信號進行調(diào)控等其它逆轉(zhuǎn)機制;Pluronic P123/F127混合膠束通過網(wǎng)格蛋白

9、和陷穴小泡兩種內(nèi)吞途徑進入細胞。
　　最后,成功制各了以葉酸為靶向頭基的載紫杉醇(PTX)Pluronic P123/F127混合膠束(FPF-PTX),并對其進行理化性質(zhì)的表征。以葉酸受體表達豐富的人口腔上皮癌細胞(KB)及耐長春新堿人口腔上皮癌細胞(KBv)為細胞模型,通過細胞毒、細胞凋亡、細胞周期、細胞共定位和內(nèi)吞機制等一系列細胞水平實驗表明,葉酸介導(dǎo)的主動靶向效應(yīng)和Pluronic自身逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的特性可協(xié)同增效,進一步

10、增強FPF-PTX逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的能力。另外,FPF-PTX通過網(wǎng)格蛋白和陷穴小泡兩種途徑入胞,具有濃度、溫度和時間依賴性,并且游離葉酸的存在對葉酸受體具有競爭性結(jié)合作用;大鼠體內(nèi)藥動學(xué)結(jié)果表明,PF-PTX與FPF-PTX的長循環(huán)效果均顯著優(yōu)于Taxol組,其AUC0→t分別是Taxol組的2.96倍和2.67倍;體內(nèi)平均滯留時間(MRT)分別是Taxol組的4.38倍和2.98倍;清除率(CL)相對于Taxol組均顯著降低,即葉酸修