霉酚酸通過表觀遺傳修飾機制對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者CD4+T細(xì)胞自身免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)是一種以T細(xì)胞異?；罨妥陨砜贵w產(chǎn)生為特點的累及多器官、多系統(tǒng)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機制目前尚不明確。霉酚酸酯(mycophenolatemofetil，MMF)是一種新型免疫抑制劑，口服后轉(zhuǎn)化為其活性形式霉酚酸(mycopenolic acid，MPA)。目前MMF被廣泛應(yīng)用于難治性狼瘡腎炎的治療。但MMF治療SLE的分子機制尚未完全

2、明確。本課題通過研究MPA對SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)狀態(tài)的影響，初步探討MPA治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的表觀遺傳學(xué)機制。
　　方法:
　　分離8例SLE患者外周血CD4+T細(xì)胞，甲醇（溶媒）及MPA(1uM)分別處理病人外周血CD4+T細(xì)胞，48小時后收集細(xì)胞;總體甲基化定量試劑盒檢測外周血CD4+T細(xì)胞中基因組DNA甲基化水平;總體組蛋白甲基化及乙?；吭噭┖袡z測外周血CD4+T細(xì)胞中組蛋白乙酰化及甲基化水平;

3、逆轉(zhuǎn)錄-實時定量聚合酶反應(yīng)(Reversetranscription-quantitative PCR，RT-qPCR)檢測組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases，HATs)和去乙?；?histone deacetylases，HDACs)的mRNA表達(dá)水平;流式細(xì)胞學(xué)及RT-qPCR檢測外周血CD4+T細(xì)胞CD40L、CD11a和CD70蛋白和mRNA表達(dá)水平;焦磷酸測序（PYRO-sequence）

4、檢測CD40L啟動子區(qū)域DNA甲基化水平;染色質(zhì)免疫共沉淀法檢測CD40L啟動子區(qū)組蛋白表觀遺傳修飾狀態(tài);酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immuno sorbent assay, ELISA）測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IgG水平。
　　結(jié)果
　　與溶媒對照組相比，MPA處理組SLE CD4+T細(xì)胞整體DNA甲基化水平無明顯改變(P=0.2701);整體組蛋白H3/H4乙?；矫黠@升高(P=0.0335，P=0.024

5、1)，而總體組蛋白H3K4/H3K9甲基化水平無明顯改變(P=0.5407，P=0.3868)。RT-qPCR結(jié)果顯示:與溶媒對照組相比，MPA處理組SLE CD4+T細(xì)胞HDAC2、HDAC7和SIRT1的mRNA水平較溶媒對照組明顯降低(P=0.0199，P=0.0425，P=0.0225)，CREBBP和PCAF mRNA水平明顯升高(P=0.0153，P=0.0201);流式細(xì)胞術(shù)及RT-qPCR檢測顯示:MPA處理組SLE C

6、D4+T細(xì)胞CD40L表達(dá)較溶媒對照組明顯降低(P=0.0032)，而CD11a及CD70的表達(dá)無明顯改變(P＞0.05)。CD4+T細(xì)胞與同源B細(xì)胞共培養(yǎng)，ELISA檢測MPA處理上清中自身抗體IgG水平較溶媒對照組顯著降低(P=0.0013)。進(jìn)一步檢測MPA對CD40L啟動子區(qū)DNA甲基化水平及組蛋白修飾狀態(tài)的影響，結(jié)果顯示:與溶媒組相比，MPA處理組SLE CD4+T細(xì)胞CD40L基因啟動子區(qū)DNA甲基化水平無明顯改變(P＞0.