白血病抑制因子對PVL新生大鼠星形膠質細胞增殖作用的研究.pdf

1、前言：
　　隨著早產(chǎn)兒發(fā)生率的不斷增加和存活率的顯著提高，早產(chǎn)兒腦損傷問題倍受關注。病理學及流行病學研究證實的早產(chǎn)兒腦損傷主要為腦白質損傷。腦室周圍白質軟化(periventricular leukomalacia，PVL)是早產(chǎn)兒腦損傷的常見類型，與腦性癱瘓等密切相關，是存活新生兒出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育和行為障礙的主要原因之一。缺氧缺血在早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)病機制學說中占主導地位。PVL主要起源于缺氧缺血所致的側腦室旁分水嶺區(qū)腦白質的損害;少突

2、膠質細胞前體細胞是PVL病變的主要靶細胞。缺氧缺血性損傷可導致晚期少突膠質細胞前體細胞凋亡，損害髓鞘形成進程，導致彌漫的髓鞘形成紊亂;促成了星形膠質細胞反應性活化增殖，發(fā)展為膠質斑痕。近年來對PVL患兒髓鞘形成障礙的機制提出了新觀點:PVL髓鞘形成障礙的可能機制與“少突膠質細胞前體細胞向成熟少突膠質細胞發(fā)育障礙”有關。新近研究表明:星形膠質細胞過度活化增殖以至膠質斑痕形成，影響了少突膠質前體細胞的細胞周期時間，抑制其正常成熟，導致髓鞘形

3、成受阻。膠質疤痕成為生理障礙阻斷生長因子傳遞，抑制髓鞘再生。星形膠質細胞活化增殖可能是抑制哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生最重要的因素。有目的的調(diào)控缺氧缺血性腦損傷后星形膠質細胞的活性，有效扼制其過度增殖帶來的負面影響，對早產(chǎn)兒腦損傷的治療將具有重要意義。
　　白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)是一種多功能的細胞因子，因其能抑制髓樣白血病細胞系的生長和促進其分化而得名。已在多種細胞中發(fā)現(xiàn)有LIF

4、的表達，LIF受體在中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布比較廣泛。近年研究認為，LIF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷病變中更多顯示的是神經(jīng)保護作用，被認為是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子。LIF具有促進少突膠質細胞存活和髓鞘形成以及抑制神經(jīng)元凋亡的功能，LIF是胚胎期星形膠質細胞從神經(jīng)前體細胞發(fā)育成熟的重要因子。鑒于LIF與少突膠質細胞、神經(jīng)元以及星形膠質細胞關系密切，明確LIF是否參與了早產(chǎn)兒腦損傷病變的損傷或修復過程，將有助于早產(chǎn)兒腦損傷的研究。目前LIF與新生期腦損傷的研究報

5、道少見，尚不清楚LIF是否以及如何影響早產(chǎn)兒腦損傷后星形膠質細胞增殖。
　　與生后7日齡大鼠不同，生后2～5日齡新生大鼠少突膠質細胞發(fā)育處于晚期少突膠質前體細胞階段;生后3日齡新生大鼠單側頸總動脈結扎聯(lián)合低氧模型能夠產(chǎn)生PVL病變，是目前國際上公認的模擬早產(chǎn)兒腦損傷的動物模型。因此本研究通過建立PVL新生大鼠動物模型，研究PVL新生大鼠腦組織內(nèi)源性LIF的表達變化，通過體內(nèi)外實驗進一步研究外源性LIF對PVL新生大鼠星形膠質細胞增

6、殖的作用，并探討其可能的機制。為早產(chǎn)兒腦損傷的治療，提供理論依據(jù)。
　　材料和方法：
　　一、動物模型與分組
　　健康清潔級3日齡(P3) Wistar大鼠，應用隨機數(shù)字表法隨機分為三組:對照組（SHAM組），實施假手術;實驗組（PVL組），實施左側頸總動脈結扎術聯(lián)合低氧;LIF干預組（PVL+LIF組）:在左側頸總動脈結扎聯(lián)合低氧術后1天腹腔注射LIF（10μg/Kg·d，連續(xù)注射7天）。實施LIF干預時，與其對照的

7、SHAM組和PVL組分別腹腔注射同等容積的無菌生理鹽水。
　　二、細胞模型與分組
　　將同批次培養(yǎng)傳至第三代的星形膠質細胞隨機分為正常培養(yǎng)組(N)和氧糖剝奪培養(yǎng)組(OGD);兩組按LIF終濃度的不同，再分別隨機分為5個不同的干預組:LIF0ng/ml組（無LIF干預組）、LIF5ng/ml組、LIF10ng/ml組、LIF30ng/ml組、LIF50ng/ml組，分別正常培養(yǎng)和OGD培養(yǎng)6小時。
　　三、標本的采集和處

8、理
　?。ㄒ唬﹦游飿吮?br>　　SHAM組和PVL組大鼠分別于缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28 d相應時間點處死，每組16只。LIF干預組及與其對照的SHAM組和PVL組于缺氧缺血后14d處死，每組8只。處死前乙醚吸入麻醉，局部消毒，依次打開腹腔、橫膈、胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室以生理鹽水灌注至流出液體清亮，（用于制作石蠟或冰凍切片的標本繼續(xù)以4％多聚甲醛灌注），斷頭取腦。待做病理形態(tài)學檢測和免疫組化的標本置4％多聚甲醛中

9、固定，石蠟包埋;待做Real-time PCR和Western blot的標本包入無菌錫紙中置液氮罐內(nèi)，冉轉移至-80℃冰箱。
　?。ǘ┘毎麡吮?br>　　棄培養(yǎng)基，PBS沖洗細胞后，用于免疫組化和免疫熒光的標本以4％多聚甲醛固定;待做Real-time PCR的標本用Trizol總RNA提取液裂解后，收集于DEPC處理的無菌Eppendorf管內(nèi)，移至-80℃冰箱;待做Western blot的標本用0.25％胰酶消化后離心去

10、上清，收集沉淀于無菌Eppendorf管內(nèi)，移至-80℃冰箱凍存。
　　四、實驗方法及檢測指標
　　1、新生大鼠腦組織HE染色檢測病理形態(tài)學改變;
　　2、免疫組化法檢測新生大鼠腦組織中GFAP和MBP蛋白的表達以及體外培養(yǎng)的星形膠質細胞PCNA蛋白表達;
　　3、免疫熒光雙標染色法檢測新生大鼠腦組織中LIF和GFAP蛋白的共表達;
　　4、CCK-8法測定體外培養(yǎng)的星形膠質細胞活力;
　　5、EdU

11、檢測體外培養(yǎng)的星形膠質細胞DNA合成;
　　6、Real-time PCR檢測新生大鼠腦組織中LIF mRNA的相對表達量;Real-time PCR檢測體外培養(yǎng)的星形膠質細胞PCNA mRNA、VEGF mRNA、miR20b-5p的相對表達量;
　　7、Western blot測定新生大鼠腦組織中LIF、GFAP和MBP蛋白表達;Westernblot測定體外培養(yǎng)的星形膠質細胞PCNA、VEGF的蛋白表達;
　　8

12、、應用LipofectamineTM2000 Transfection Reagent對體外培養(yǎng)的星形膠質細胞轉染siR-RiboTM Transfection Control(Cy3)和miR-RiboTM miRNA inhibitor negative control和miR-RiboTMmiR20b-5p inhibitor。
　　五、統(tǒng)計學分析
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0軟件處理，計量資料以均數(shù)±標準差表示，

13、組間比較采用t檢驗，各組內(nèi)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進行正態(tài)分布及方差齊性檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　結果：
　?。ㄒ唬w內(nèi)實驗
　　1、新生大鼠腦組織HE染色檢測病理形態(tài)學改變
　　缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d各組大鼠腦組織HE染色結果顯示:HI后3d左側（結扎側）側腦室周圍白質區(qū)開始出現(xiàn)篩網(wǎng)狀壞死灶，HI后7d開始出現(xiàn)左側側腦室擴大表現(xiàn)。HI后14d實驗組大

14、鼠病變程度明顯加重，左側側腦室較對側及對照組明顯擴大，左側腦白質組織結構稀疏模糊，腦室旁細胞排列紊亂，神經(jīng)纖維走向紊亂，側腦室周圍可見囊性疏松壞死區(qū)域形成。HI后28d，實驗組大鼠病變與HI后14d相似，病變程度未見明顯加重。
　　2、缺氧缺血后新生大鼠腦白質變化
　　采用GFAP和MBP免疫組織化學染色方法對缺氧缺血后1d、3d、7d、14d、28d各組大鼠腦白質變化進行觀察。GFAP染色結果顯示:HI后3d實驗組左側（結

15、扎側）側腦室周圍白質區(qū)GFAP染色陽性細胞數(shù)開始較對照組明顯增多，14d時達高峰;28d時較前有所下降，但仍明顯高于對照組。免疫組織化學圖像分析結果顯示:除HI后1d外，其余各時間點實驗組GFAP的平均光密度值高于相應對照組(P＜0.01);實驗組各時間點比較，HI后14d組GFAP的平均光密度值最高，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　MBP染色結果顯示:HI后1d和3d時，實驗組和對照組大鼠腦室周圍白質區(qū)均未見MBP陽性染色。

16、HI后7d時，對照組大鼠外囊、內(nèi)囊和胼胝體等部位MBP免疫染色陽性;實驗組結扎側上述部位MBP陽性染色弱于對照組（P＜0.05）。HI后14d時，對照組大鼠腦室周圍白質區(qū)MBP表達豐富，與HI后7d的對照組比較，MBP陽性染色明顯增強;實驗組結扎側相應部位MBP陽性染色較對照組明顯減弱（P＜0.01）。HI后28d時，實驗組和對照組大鼠上述部位MBP陽性染色均較14d時有所增強，但實驗組仍明顯弱于對照組(P＜0.01)。
　　3、

17、缺氧缺血后新生大鼠腦組織LIF mRNA表達的時程變化
　　實驗組結扎側腦組織LIF mRNA于HI后1d時表達增加，3d時達高峰，7d時表達下降，但仍高于對照組;HI后7d內(nèi)，實驗組LIFmRNA表達呈先升高后降低的趨勢，與相應時間點對照組比較，有統(tǒng)計學差異（P＜0.01）。HI后14d時實驗組LIF mRNA降至正常對照組水平，HI后28d實驗組LIF mRNA低水平表達。實驗組各時間點比較，HI后3d LIF mRNA表達升

18、高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　4、缺氧缺血后新生大鼠腦組織LIF蛋白表達的時程變化
　　Western blot測定缺氧缺血損傷后不同時間點LIF蛋白的表達變化。實驗組結扎側腦組織LIF蛋白表達呈先升高后降低的趨勢;HI后1d時表達升高，3d時達高峰，7d時表達較前下降，HI后14天時降至正常對照組水平，HI后28d時維持低水平表達。HI后7d內(nèi)實驗組與相應時間點對照組比較，LIF蛋白表達量有統(tǒng)計學差異(P＜0

19、.01); PVL組內(nèi)，HI后3d LIF蛋白表達量高于其他各時間點，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　5、缺氧缺血后新生大鼠腦組織LIF與GFAP免疫熒光雙標染色
　　取HI后3天實驗組大鼠，進行LIF與GFAP免疫熒光雙標染色。雙標結果顯示LIF與GFAP存在共表達，GFAP標記的星形膠質細胞表達LIF蛋白。
　　6、外源性LIF對PVL新生大鼠腦組織GFAP和MBP蛋白表達的影響
　　本研究應用小劑量

20、LIF（10μg/Kg，連續(xù)7天腹腔注射）干預PVL新生大鼠，動態(tài)監(jiān)測新生大鼠缺氧缺血后2周內(nèi)體重變化，結果顯示LIF的應用對新生大鼠體重無影響。LIF注射結束后7天（HI后14d），LIF干預組新生大鼠腦組織GFAP蛋白水平與PVL組比較有輕微下降趨勢（下降8％）（P＜0.05）;LIF干預組新生大鼠腦組織MBP蛋白表達水平與PVL組比較無差異。
　　（二）體外實驗
　　1、原代大鼠星形膠質細胞的培養(yǎng)及鑒定
　　GF

21、AP免疫細胞化學染色證實為星形膠質細胞，陽性率達95％以上。
　　2、不同濃度LIF干預后星形膠質細胞活力變化
　　相同濃度LIF干預的正常培養(yǎng)(N)組和氧糖剝奪(OGD)培養(yǎng)組比較，OGD組細胞活力增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）;但正常培養(yǎng)組內(nèi)不同濃度LIF作用后細胞活力無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義。OGD組內(nèi)比較，LIF10ng/ml組細胞活力降低（P＜0.05）。
　　3、不同濃度LIF干預后星形膠質細胞

22、EdU陽性率的變化
　　正常培養(yǎng)組內(nèi)比較，LIF10ng/ml組與無LIF干預組星形膠質細胞EdU陽性率無差異。OGD組與相同濃度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培養(yǎng)組比較，EdU陽性率顯著提高(P＜0.01)。OGD組內(nèi)比較，LIF10 ng/ml組EdU陽性率降低(P＜0.05)。
　　4、不同濃度LIF干預后星形膠質細胞PCNA mRNA表達變化
　　正常培養(yǎng)組內(nèi)比較，LIF10ng/ml組

23、與無LIF干預組星形膠質細胞PCNAmRNA的表達無統(tǒng)計學差異。OGD組與相同濃度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培養(yǎng)組比較，PCNA mRNA的表達上調(diào)(P＜0.01)。OGD組內(nèi)，LIF10 ng/ml組PCNA mRNA表達下調(diào)（P＜0.05）。
　　5、不同濃度LIF干預后星形膠質細胞PCNA蛋白表達變化
　　通過免疫細胞化學染色和Western blot檢測了不同濃度LIF干預后PCNA蛋白表

24、達變化，結果顯示:正常培養(yǎng)組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無LIF干預組星形膠質細胞PCNA蛋白的表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）;OGD組與相同濃度LIF(LIF0ng/ml、LIF10ng/ml)正常培養(yǎng)組比較，PCNA蛋白的表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。OGD組內(nèi)，LIF10ng/ml組PCNA蛋白表達下調(diào)，有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。
　　6、LIF干預后星形膠質細胞VEGF mRNA的表達變化
　　L

25、IF10ng/ml對正常培養(yǎng)組星形膠質細胞的VEGF mRNA的表達無影響。無LIF干預的OGD組與無LIF干預的正常培養(yǎng)組比較，VEGF mRNA表達顯著上調(diào)(P＜0.01); OGD組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無LIF干預組比較，VEGF mRNA表達顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　7、LIF干預后星形膠質細胞VEGF蛋白的表達變化
　　LIF10ng/ml對正常培養(yǎng)組星形膠質細胞的VEGF蛋白表達無影響。無LIF干預

26、的OGD組與無LIF干預的正常培養(yǎng)組比較，VEGF蛋白表達顯著增加(P＜0.01);OGD組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無LIF干預組比較，VEGF蛋白表達減少(P＜0.05)。
　　8、LIF干預后星形膠質細胞miR20b-5p的表達變化
　　LIF10ng/ml對正常培養(yǎng)組星形膠質細胞miR20b-5p的表達無影響。無LIF干預的OGD組與無LIF干預的正常培養(yǎng)組比較，miR20b-5p的表達顯著下調(diào)(P＜0.05);O

27、GD組內(nèi)，LIF10ng/ml組與無LIF干預組比較，miR20b-5p的表達上調(diào)(P＜0.05);miR20b-5p的變化趨勢與VEGF mRNA及蛋白的變化趨勢相對應（負相關）。
　　9、miR20b-5p抑制劑轉染后實驗結果
　　(1)星形膠質細胞轉染效率
　　通過Lipo2000轉染Cy3標記的siRNA熒光對照，分別以50nM、100nM的濃度進行轉染，結果顯示100nM濃度的轉染效率明顯高于50nM組。

28、r>　　(2) miR20b-5p抑制劑轉染后星形膠質細胞VEGF蛋白的表達變化
　　正常培養(yǎng)條件下:轉染miR20b-5p抑制劑對VEGF蛋白的表達無影響。
　　氧糖剝奪培養(yǎng)條件下:①不論有無LIF干預，轉染miR20b-5p抑制劑組與轉染陰性對照組比較，VEGF蛋白表達均增加(P＜0.05)，但LIF干預后VEGF蛋白增加的程度(23％)大于無LIF干預的條件下(12％);②不論轉染miR20b-5p抑制劑亦或是轉染陰性

29、對照，LIF(10ng/ml)干預組與無LIF干預組比較，VEGF蛋白表達均減少(P＜0.05)，但轉染miR20b-5p抑制劑后VEGF蛋白減少的程度(13％)小于轉染陰性對照條件下(21％)。
　　(3) miR20b-5p抑制劑轉染后星形膠質細胞增殖變化（EdU陽性細胞率）
　　正常培養(yǎng)條件下:轉染miR20b-5p抑制劑對EdU陽性細胞率無顯著影響。
　　氧糖剝奪培養(yǎng)條件下:①不論有無LIF干預，轉染miR20

30、b-5p抑制劑組與轉染陰性對照組比較，EdU陽性細胞率均升高(P＜0.05)，但LIF干預后EdU陽性細胞率升高的程度(53％)大于無LIF干預的條件下(33％);②不論轉染miR20b-5p抑制劑還是轉染陰性對照，LIF(10ng/ml)干預組與無LIF干預組比較，EdU陽性細胞率均降低（P＜0.05），但轉染miR20b-5p抑制劑后EdU陽性細胞率降低的程度(18％)小于轉染陰性對照條件下(29％)。
　　結論：
　　

31、1、 PVL新生大鼠腦組織中星形膠質細胞數(shù)量增加，存在星形膠質細胞反應性增殖。
　　2、 PVL新生大鼠腦組織表達LIF蛋白，其表達變化呈先升高后降低的趨勢:缺氧缺血后1天時表達增加，3天時達高峰，7天時表達較前下降，14天時降至正常對照組水平，28天時維持低水平表達。LIF mRNA的變化趨勢與LIF蛋白一致。PVL新生大鼠腦組織中星形膠質細胞表達LIF。外源性LIF可抑制PVL新生大鼠腦組織GFAP蛋白的表達。
　　3、