過表達肌漿網鈣ATP酶2a對心肌細胞PI3K-Akt信號通路短期作用的研究.pdf

1、心力衰竭是各種心臟疾病發(fā)展的最終歸宿，是導致患者死亡的主要原因。目前針對慢性心衰的治療已有長足發(fā)展，但其五年死亡率仍居高不下。分子生物學研究提示心力衰竭心肌細胞中存在某些相關基因表達和調控異常，因此心衰被認為是一種多基因突變疾病?；蛑委煘樾牧λソ咛峁┝诵碌闹委熗緩健＜{網Ca2+轉運障礙是各種心力衰竭的共同通路，肌漿網鈣ATP酶2a（sarcoplasmic reticulum calcium ATPase 2a，SERCA2a）是調

2、節(jié)細胞內Ca2+穩(wěn)態(tài)的決定因素。既往研究表明，轉基因過表達SERCA2a可以改善心力衰竭心肌細胞的功能、糾正Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡、延長存活時間和逆轉心室肥厚等。為了更好的評價這種治療方法，就必須探討其保護心肌的分子機制。本實驗室前期的研究工作顯示轉基因過表達SERCA2a可使心肌細胞內與提供能量有關的酶類表達增加，并糾正MHC亞型的異常表達。其他研究小組發(fā)現轉基因過表達SERCA2a可以糾正心力衰竭時蛋白激酶B（Akt1）的異常表達。

3、>　　 蒽環(huán)類抗生素廣泛應用于各種惡性腫瘤的治療，但其存在嚴重的心臟毒性。心力衰竭是此類藥物心臟毒性的最終表現。研究顯示，蒽環(huán)類藥物影響心肌細胞SERCA2a蛋白的表達和功能，SERCA2a功能改變是此類藥物導致心臟毒性的關鍵因素。另外蒽環(huán)類藥物誘發(fā)心肌毒性與心肌細胞內Akt磷酸化水平降低有關。大量事實證明，多種心肌保護因子通過激活Akt通路抑制蒽環(huán)類藥物的心肌毒性。
　　 Akt是一種蛋白質絲/蘇氨酸激酶，心肌細胞主要表達A

4、kt1亞型。胰島素等各種生長因子通過磷酯酰肌醇3-激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）激活Akt，Akt被激活后廣泛參與調節(jié)心肌細胞生長、能量代謝和抗調亡等過程。Akt是細胞內信號傳導通路網絡的中心分子，短期適度激活Akt對心肌細胞有保護作用，而大量長期激活會促進心力衰竭的發(fā)生。轉基因過表達SERCA2a可以改善心力衰竭動物的長期預后，而過表達SERCA2a可以糾正心衰心肌細胞Akt1的異常表達，

5、因此我們推測過表達SERCA2a的長期有益作用可能與糾正Akt1通路的異常有關。
　　 本研究在體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞系和原代心肌細胞，采用重組腺病毒轉基因瞬時過表達SERCA2a，觀察過表達SERCA2a對正常心肌細胞P13K/Akt信號通路的作用，并探討此通路下游分子GSK3β和GLUT4活性改變情況，明確在正常心肌細胞過表達SERCA2a是否可以激活PI3K/Akt通路。首先，本研究采用HEK-293T細胞擴增重組腺病

6、毒Ad-GFP和Ad-SERCA2a，并驗證擴增后的腺病毒在體外可以有效感染目的細胞。利用Ad-GFP感染H9c2心肌細胞和MTT實驗觀察病毒感染對心肌細胞損傷程度，確定最佳感染復數（MOI）值，為后期實驗奠定基礎。其次，通過在體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞系和原代心肌細胞內轉基因過表達SERCA2a，觀察對Akt通路的影響。結果顯示，在體外培養(yǎng)的H9c2心肌細胞過表達SERCA2a可以激活Akt，Akt磷酸化水平升高，是對照組的2.7倍（

7、P<0.05）；其下游底物GSK3β磷酸化水平升高，是對照組的3.1倍（P<0.05）；GLUT4蛋白表達無明顯變化，但通過免疫熒光染色發(fā)現有GLUT4由細胞漿移位至細胞膜的現象。進一步細胞膜蛋白分析顯示，過表達SERCA2a組細胞膜GLUT4蛋白量增加，是對照組的2.1倍（P<0.05）。在原代心肌細胞過表達SERCA2a也可以激活Akt通路，Akt磷酸化水平升高，是對照組的2.1倍（P<0.05）；其下游底物GSK3β磷酸化水平升高

8、，是對照組的1.6倍（P<0.05）；采用PI3K抑制劑LY294002可以阻斷以上蛋白磷酸化水平改變，提示過表達SERCA2a通過PI3K激活Akt通路。最后，采用阿霉素誘導心肌細胞壞死，觀察過表達SERCA2a對阿霉素誘導心肌損傷的影響。結果顯示，阿霉素誘導心肌細胞壞死時，細胞LDH漏出量增加，細胞內Ca2+離子水平升高，SERCA2a蛋白表達降低。過表達SERCA2a可以抑制阿霉素誘導的心肌損傷，表現為心肌細胞死亡率降低，心肌細胞