線粒體D環(huán)單核苷酸基因多態(tài)與惡性纖維組織細(xì)胞瘤預(yù)后之間的關(guān)系研究.pdf

1、目的:線粒體單核苷酸基因多態(tài)被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有重要關(guān)系。在之前的研究中，我們證實(shí)了線粒體單核苷酸基因多態(tài)與惡性纖維組織細(xì)胞瘤發(fā)病率之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，在本實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步研究和探討線粒體單核苷酸基因多態(tài)與惡性纖維組織細(xì)胞瘤臨床特征與預(yù)后之間的關(guān)系，從而為惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者篩查出不良預(yù)后人群并為該腫瘤的治療提供一種方法。
　　方法:收集2002年到2011年間在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院接受治療的惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者

2、的血液標(biāo)本80例，同時(shí)收集自100個(gè)健康對照組的血液標(biāo)本。對實(shí)驗(yàn)對象進(jìn)行相關(guān)臨床信息采集，完善臨床資料。對患者進(jìn)行隨訪，隨訪期限為3年。
　　應(yīng)用GENMED全血線粒體DNA萃取試劑盒提取惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者及健康人的線粒體DNA，提取后將其置于-20℃恒溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>　　對目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析:PCR擴(kuò)增的上游引物序列是5'-CCCCATGCTTACAAGCAAGT-3'(核苷酸16190-16209)

3、下游引物是5'-GCTTTGAGGAGGT AAGCTAC-3'（核苷酸602-583）。PCR反應(yīng)體系約50uL(10×Buffer5 uL,2.5mmol/L MgCl22uL,10mmol/L dNTP2uL,10mmol/L引物各2uL，Taq酶3-5uL)，血漿DNA提取物6uL作為模板DNA，陽性對照模板和健康組模板為2uL，約2ng。PCR的條件是:95℃下預(yù)變性2分鐘，然后95℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下

4、延伸1分鐘，接著在72℃下延伸5分鐘，后三個(gè)步驟反復(fù)進(jìn)行35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳提純，應(yīng)用循環(huán)測序法對合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測通測序。
　　計(jì)算其3年生存率，同時(shí)分析與患者臨床特征的關(guān)系。參照基因數(shù)據(jù)庫AC_000021號數(shù)據(jù)，從已經(jīng)完成的惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者線粒體D環(huán)區(qū)的982bp序列中找出單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，對不同單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)與患者3年生存率的關(guān)系進(jìn)行分析.
　　用Kaplan-Meier的

5、統(tǒng)計(jì)方法對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)并對數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og-rank校正來生成患者的生存曲線。用Cox proportional hazards model對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素分析。所有的數(shù)據(jù)處理均用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:我們用Kaplan-Meier的統(tǒng)計(jì)方法對這些患者的臨床特點(diǎn)隨訪數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并用log-rank進(jìn)行校正。這些臨床體征包括:性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤位置

6、。年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者術(shù)后的預(yù)后存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，P值分別是0.017，0.001，0.015。在惡性纖維組織細(xì)胞瘤組以及對照組的長為982bp的線粒體D環(huán)區(qū)域我們共發(fā)現(xiàn)71個(gè)線粒體單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)，其中的28個(gè)位點(diǎn)在患者或者對照組中的頻率≥5％，可以用來分析患者預(yù)后情況。5個(gè)線粒體基因單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)與惡性纖維組織細(xì)胞瘤預(yù)后之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，這5個(gè)線粒體基因多態(tài)位點(diǎn)分別是152，16390

7、,16290，16304，523-524。擁有單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)152C，16390A，16290T的患者被證實(shí)術(shù)后3年生存時(shí)間較擁有152T，16390G，16290C的患者術(shù)后生存時(shí)間短。恰恰相反，擁有單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)16304C，523和524位點(diǎn)的AC堿基缺失的患者術(shù)后3年生存時(shí)間較擁有16304T以及523-524AC位點(diǎn)患者生存時(shí)間長。相應(yīng)的，他們的P值分別是0.047，0.016,0.043,0.043,0.029。

8、
　　在對這5個(gè)單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)與年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行多因素分析后我們證實(shí)線粒體單核苷酸基因多態(tài)位點(diǎn)16290上的C→T突變、16390位置上的G→A突變以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、腫瘤直徑大小是評估惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者術(shù)后生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)測因素。
　　結(jié)論:線粒體D環(huán)區(qū)域是一個(gè)高度變異的多態(tài)性區(qū)域，該區(qū)域與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。線粒體單核苷酸基因多態(tài)與惡性纖維組織細(xì)胞瘤患者預(yù)后之間存在著統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性