PPy-CS和FK506表面修飾對(duì)生物材料促成骨作用研究.pdf

1、第一部分PPy-CS涂層表面修飾對(duì)植入物界面促骨整合能力的影響
　　目的:評(píng)價(jià)PPy-CS涂層修飾植入物后在兔子體內(nèi)生物相容性及促骨整合的能力。
　　方法:選擇17只雌性、體重在3.20±0.20 kg的新西蘭大白兔，將PPy-CS涂層修飾的可吸收釘及未經(jīng)涂層修飾的兩種螺釘及臨床應(yīng)用的不銹鋼釘植入新西蘭大白兔雙側(cè)的下肢中，每側(cè)下肢植入一種類(lèi)型螺釘，脛骨上端植入2枚釘子，股骨髁部植入1枚釘子;其中12只實(shí)驗(yàn)兔用作分別觀察12周

2、及26周，另外5只實(shí)驗(yàn)兔用作觀察12周時(shí)的力學(xué)測(cè)試。通過(guò)觀察實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前術(shù)后的飲食、飲水、體重、體溫、術(shù)后的體征、血液生化檢測(cè)、安樂(lè)死后器官重量及病理檢測(cè)，釘子周緣的軟組織的大體觀及病理檢測(cè)，μ-CT檢測(cè)釘子周緣的成骨情況，以及釘子進(jìn)行硬組織切片檢測(cè)，來(lái)明確該涂層的兼容性及在12w及26w時(shí)的在釘子周緣的促成骨能力。
　　結(jié)果:涂層組與未涂層組實(shí)驗(yàn)兔均生長(zhǎng)良好，2組在術(shù)前術(shù)后的飲食、飲水、體重、體溫、術(shù)后的體征、血液生化檢測(cè)、安樂(lè)死

3、后器官重量及病理檢測(cè)，釘子周緣的軟組織的大體觀及病理檢測(cè)，釘子的硬組織切片檢測(cè)等觀察結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后，均未見(jiàn)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明該P(yáng)Py-CS涂層應(yīng)用于動(dòng)物體內(nèi)后，在12w及26w的觀察期限內(nèi)，均未見(jiàn)系統(tǒng)及局部的毒副反應(yīng);經(jīng)μ-CT、扭力測(cè)試、四環(huán)素?zé)晒鈾z測(cè)及硬組織的甲苯胺藍(lán)染色后發(fā)現(xiàn)，涂層組較未涂層組的結(jié)果在12w及26w均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說(shuō)明PPy-CS涂層具有較好的促成骨能力。
　　結(jié)論:PPy

4、-CS涂層表面修飾的生物材料，在植入動(dòng)物體內(nèi)12w及26w時(shí)生物相容性良好，同時(shí)具有良好的促骨整合的能力。
　　第二部分FK506表面修飾對(duì)多孔支架成骨效能體外研究
　　目的:體外檢測(cè)緩釋不同濃度FK506的多孔PLA/β-TCP支架對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)作用的研究。
　　方法:利用微米級(jí)β-TCP高能球磨法制備納米級(jí)β-TCP(Nβ-TCP)，將聚乳酸(PLA)與納米β-TCP顆?；旌现频忙?TCP質(zhì)量百分比為30％

5、的混合溶液(70PLA/30β-TCP)，再稱取不同比例的FK506加入上述溶液中，混合均勻后注入特制的聚四佛乙烯模具，凍干后制備表面修飾了不同F(xiàn)K506質(zhì)量百分比濃度的多孔支架材料，制成統(tǒng)一5mm×5mm×3mm大小。利用ELISA試劑盒檢測(cè)上述含不同F(xiàn)K506濃度的支架材料分別在0.33、0.66、1、2、6、12、24、48、96、144、336、720h時(shí)間點(diǎn)藥物緩釋情況，初步明確其藥物緩釋曲線。另取來(lái)自人的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(B

6、MSCs)以1×106/30μl接種于不同F(xiàn)K506濃度的多孔支架，體外共培養(yǎng)2周，其中培養(yǎng)1周時(shí)隨機(jī)取支架-細(xì)胞復(fù)合物在電鏡下觀察。在培養(yǎng)1周、2周時(shí)，分別取培養(yǎng)液進(jìn)行OCN檢測(cè)，取出復(fù)合細(xì)胞的多孔支架經(jīng)研磨、裂解后進(jìn)行ALP檢測(cè)。
　　結(jié)果:成功獲得5種含F(xiàn)K506不同質(zhì)量百分比(0％、2％、4％、6％、8％)的納米級(jí)PLA/β-TCP多孔支架。獲得了上述經(jīng)FK506修飾的多孔支架的藥物緩釋曲線，6％組的FK506的釋放量較其

7、他各組均有增高。細(xì)胞-支架培養(yǎng)1周后電鏡觀察示BMSCs在多孔支架內(nèi)生長(zhǎng)良好。支架與細(xì)胞共培養(yǎng)1周時(shí)，5種不同濃度的多孔支架經(jīng)裂解、研磨后，發(fā)現(xiàn)6％質(zhì)量百分比的支架ALP值較其他各組高，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，5組間未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;2周時(shí)，各組的ALP均值較前有增高，6％組與其他幾組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在支架與細(xì)胞共培養(yǎng)后1周時(shí)，對(duì)5種不同濃度的多孔支架的培養(yǎng)液進(jìn)行OCN檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6％組OCN檢測(cè)值較其他各組均有增高（P＜0.05

8、）;而在2周時(shí)，6％組與8％組OCN值均較其他各組明顯增高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，6％組與8％組均較其他3組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但該兩組間未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論:BMSCs可以在經(jīng)FK506表面修飾的納米級(jí)多孔PLA/β-TCP內(nèi)生長(zhǎng)，6％組多孔支架有較好的藥物緩釋曲線，同時(shí)對(duì)該組在體外復(fù)合BMSCs后的ALP及OCN檢測(cè)，初步認(rèn)為6％質(zhì)量百分比的經(jīng)FK506修飾的N-PLA/β-TCP在體外促成骨方面可

9、能有一定的優(yōu)勢(shì)。
　　第三部分FK506表面修飾對(duì)多孔支架材料在動(dòng)物體內(nèi)生物相容性及促成骨效能的影響
　　目的:探討經(jīng)FK506修飾的N-PLA/β-TCP多孔支架在動(dòng)物體內(nèi)生物相容性及促成骨的作用，從而結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)明確最佳的FK506修飾濃度。
　　方法:將不同質(zhì)量百分比FK506分別修飾的N-PLA/β-TCP多孔支架制作成5mm×5mm×3mm大小，輻射消毒后備用。用DiI及Brdu標(biāo)記人BMSCs，以1×106

10、/30μl接種于上述5種支架材料中。在共培養(yǎng)2周時(shí)，將接種細(xì)胞多孔支架材料植入8只新西蘭大白兔背部皮下，同時(shí)取4只作為單純多孔支架材料的對(duì)照。于術(shù)后觀察實(shí)驗(yàn)兔的體征、飲食、飲水、切口局部的反應(yīng)等，4周和8周實(shí)驗(yàn)兔安樂(lè)死后取標(biāo)本周邊軟組織進(jìn)行大體觀察及組織學(xué)檢查，標(biāo)本的大體觀察、常規(guī)組織學(xué)及免疫組織化學(xué)染色觀察。術(shù)后4周、8周，標(biāo)本周緣的軟組織行石蠟包埋，常規(guī)HE染色;所有標(biāo)本一分為二切開(kāi)，部分標(biāo)本做冰凍切片，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下示

11、蹤BMSCs、OCN免疫熒光及ALP免疫組化;另一部分進(jìn)行石蠟包埋，行HE染色、OCN、Ⅰ型膠原免疫組化檢測(cè)。
　　結(jié)果:經(jīng)FK506表面修飾的N-PLA/β-TCP多孔支架與BMSCs的復(fù)合物及該單純多孔支架在植入新西蘭大白兔背部皮下后，術(shù)后均未見(jiàn)明顯的異常體征、飲食、飲水、體重等，手術(shù)切口處未見(jiàn)明顯的紅、腫、熱或明顯的包囊結(jié)構(gòu)等異常表現(xiàn)。術(shù)后4周、8周，實(shí)驗(yàn)兔安樂(lè)死后，各組標(biāo)本周緣的軟組織大體觀及組織學(xué)均未見(jiàn)明顯的炎癥等異常表

12、現(xiàn);標(biāo)本熒光顯微鏡下觀察見(jiàn)DiI標(biāo)記的細(xì)胞存活于多孔支架中，Brdu標(biāo)記的細(xì)胞可見(jiàn)與Brdu抗體的結(jié)合反應(yīng)，進(jìn)一步說(shuō)明在該類(lèi)型多孔支架中BMSCs可以正常存活生長(zhǎng)。4周時(shí)，5組標(biāo)本經(jīng)常規(guī)HE染色及免疫組化檢測(cè)后，6％組的新生編織骨量明顯較其他各組均增多（P＜0.05），6％組的ALP、OCN、ColⅠ等成骨指標(biāo)陽(yáng)性表達(dá)率經(jīng)半定量評(píng)分均較其他各組有不同程度的提高(P＜0.05);8周時(shí)，6％與8％組的新生編織骨量明顯較其他各組均增多(P＜