一例日本對蝦暴發(fā)性死亡的病原分析及益生菌聯(lián)用對對蝦免疫增強作用.pdf

1、第一部分：一例日本囊對蝦暴發(fā)性死亡的病原分析
　　為了闡明山東省濰坊市1對蝦養(yǎng)殖場發(fā)生日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）暴發(fā)性死亡的原因，采用分子生物學檢測方法，對發(fā)病對蝦進行了白斑綜合征病毒（White spot syndrome virus,WSSV）、桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus,TSV）、黃頭病毒（Yellow head virus,YHV）、傳染性皮下及造血組織壞死病毒

2、(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)、傳染性肌肉壞死病毒（Infectious myonecrosis virus，IMNV）、偷死野田村病毒（Covert mortality nodavirus，CMNV）及急性肝胰腺壞死?。ˋcute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND）7種病原的檢測，且對發(fā)病對蝦進

3、行了常規(guī)組織病理學觀察。同時采用16SrDNA細菌鑒定方法及浸泡回接感染實驗對分離自發(fā)病對蝦體內(nèi)的可疑病原菌進行了分子鑒定及毒力測試。結(jié)果顯示，發(fā)病對蝦樣品核酸檢測呈現(xiàn)WSSV強陽性，IHHNV和CMNV為弱陽性，其他4種病原為陰性。組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)，在對蝦的胃、鰓等上皮組織中存在WSSV包涵體，頭部肌肉纖維出現(xiàn)離散。對分離的編號為2901、2902、2903的3株優(yōu)勢可疑病原菌鑒定結(jié)果表明，3株菌分別與印度格里蒙菌（Grimonti

4、a indica）、交替單胞菌（Alteromonas sp.）及溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）相似，相似度分別為99％、99%及100%。攻毒結(jié)果顯示3株可疑病原菌的LC50分別為9.8×107CFU/mL、1.1×108 CFU/mL與2.3×108 CFU/mL，各細菌毒力均較弱，非導致對蝦出現(xiàn)暴發(fā)性死亡的病原。綜合上述結(jié)果推斷，導致本次日本囊對蝦暴發(fā)死亡的病因與混合感染病原WSSV、IHHNV、CMNV有關(guān)

5、，其中WSSV感染是造成日本囊對蝦暴發(fā)死亡的主因，研究結(jié)果可為解析當前養(yǎng)殖日本囊對蝦疾病暴發(fā)及其成因提供參考。
　　第二部分：益生菌聯(lián)用對對蝦免疫增強作用
　　為了研究有益菌防控對蝦AHPND的效果，將假交替單胞菌（Pseudoalteromonas.sp.）、鹽單胞菌（Halomonas.sp）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtitles）、腸膜明串珠菌（Leucon

6、ostoc mesemteroides）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、復(fù)合菌1（鹽單胞菌、地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、腸膜明串珠菌、釀酒酵母菌）及復(fù)合菌2（假交替單胞菌、鹽單胞菌、腸膜明串珠菌、釀酒酵母菌）分別添加到凡納濱對蝦養(yǎng)殖水體及飼料中，養(yǎng)殖15d時，取部分實驗蝦人工感染副溶血弧菌(V.parahaemolyticus,VPAHPND)，分析評價對蝦的抗感染能力，養(yǎng)殖30d后統(tǒng)計實驗對

7、蝦存活率。同時，分析對蝦血清樣品及組織樣品免疫及消化相關(guān)酶活。并對各實驗組養(yǎng)殖水樣及實驗對蝦腸道微生物樣品進行多樣性分析。
　　結(jié)果顯示，各組對蝦人工感染VPAHPND后，枯草芽孢桿菌、假交替單胞菌、復(fù)合1、復(fù)合2、地衣芽孢桿菌、鹽單胞菌、腸膜明串珠菌、釀酒酵母菌各組的死亡率分別為37.5%、45.8%、50.0%、41.6%、54.1%、58.3%、62.5%及70.8%，均顯著低于對照組的死亡率80.0%；養(yǎng)殖期間統(tǒng)計各組的養(yǎng)

8、殖存活率顯示，復(fù)合1組、復(fù)合2組、枯草芽孢桿菌組、假交替單胞菌組、地衣芽孢桿菌組、鹽單胞菌組、腸膜明串珠菌組、釀酒酵母菌組的存活率分別為65.0%、60.4%、54.7%、50%、53.8%、52.8%、49.9%、53.0%，均高于對照組的存活率40.0%。
　　對各實驗組血清樣品進行溶菌酶、酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）和肝胰腺、腸道樣品進行脂肪酶（LBS）、淀粉酶（AMS）的活力分析。結(jié)果顯示，復(fù)合2組（69.2

9、）、地衣芽孢桿菌組（39.2）、枯草芽孢桿菌組（34.7）、腸膜明串珠菌組（65.6）、假交替單胞菌組（56.9）的PO活力顯著高于對照組（8.0）（P＜0.05）；復(fù)合1組的LBS活力（9.38）顯著高于對照組(0.4)（P＜0.05）。本實驗所用有益菌對血清中的SOD活力及肝胰腺、腸道樣品中的AMS活力不具有增強作用，對血清中的溶菌酶活力作用不大。
　　對各實驗組養(yǎng)殖水樣及實驗對蝦腸道樣品進行微生物多樣性分析，結(jié)果顯示，實驗組

10、與對照組養(yǎng)殖水體中微生物多樣性組成存在差異，養(yǎng)殖水體中主要菌群為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門(Proteobacteria)、防線菌門(Actinobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、浮霉門(Planctomycetes)、綠菌門(Chlorobi)，其中優(yōu)勢菌為擬桿菌門，占復(fù)合1組的54.5%、復(fù)合2組的55.0%、地衣芽孢桿菌組的34.8%、枯草芽

11、孢桿菌組的55.0%、假交替單胞菌組的34.0%、腸膜明串珠菌組的32.5%，且實驗組均低于對照組的69.1%；對蝦腸道中微生物區(qū)系主要組成為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門（Bacteroidetes）、防線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)，且實驗組與對照組中的菌群組成比例相似。其中變形菌門與擬桿菌門為主要菌群，二者占菌群的80%以上。研究結(jié)果表明，有益菌的聯(lián)用對防控對