c—Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)缺血再灌注心肌作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景目的： 心肌缺血再灌注損傷是指缺血期處于可逆損傷的心肌細(xì)胞經(jīng)恢復(fù)血液供應(yīng)后轉(zhuǎn)化為不可逆損傷。隨著冠脈溶栓術(shù)、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)等技術(shù)的推廣應(yīng)用，心肌缺血再灌注損傷作為阻礙缺血心肌從再灌注療法中獲得最佳療效的主要難題，一直備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。 凋亡是活性基因控制的細(xì)胞程序性死亡，在心肌再灌注損傷中起重要作用。多發(fā)生在缺血后再供氧的過程中，這種細(xì)胞死亡是被細(xì)胞內(nèi)一系列相關(guān)的分子所調(diào)控。細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)及調(diào)控過程極其復(fù)雜，而

2、對(duì)于細(xì)胞凋亡的機(jī)制的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，特別對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的研究知之更少。 最近的研究表明，在心肌缺血再灌注導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的過程中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中的JNK和p38-MAPKs起了重要作用。再灌注所產(chǎn)生的氧化物可使JNKMAPK得以激活，進(jìn)而使得細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，細(xì)胞因子的產(chǎn)生與JNK絲裂原活化蛋白激酶(JNKMAPK)途徑密切相關(guān)?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子數(shù)量眾多(約100多種)，許多研究證實(shí)，細(xì)胞因子通過多種途徑

3、參與組織缺血/再灌注損傷。近幾年的臨床前和臨床研究中，通過阻斷封閉細(xì)胞因子(如給予IL-1Ra，sTNF-R等)效果均不理想，主要原因可能為細(xì)胞因子及代謝產(chǎn)物數(shù)量眾多，僅針對(duì)其中某一種或幾種進(jìn)行干預(yù)，往往達(dá)不到預(yù)期目的。但進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的信息通道卻為數(shù)較少，如能對(duì)其中關(guān)鍵的信號(hào)通路進(jìn)行有效阻斷和調(diào)節(jié)，這對(duì)于阻斷凋亡調(diào)控的細(xì)胞因子及應(yīng)激蛋白的表達(dá)，具有目標(biāo)明確，效果明顯的優(yōu)勢(shì)。 JNKMAPK通路是參與凋亡及炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要信號(hào)系統(tǒng)

4、。給予特異性的阻斷劑，在信號(hào)通路水平阻斷和調(diào)控JNKMAPK的表達(dá)和活性，將可能成為治療心肌缺血再灌注損傷一條新的治療途徑。 SP600125，是一種非常有效的選擇性抑制JNK-1,-2,-3的抑制劑，通過可逆性地競(jìng)爭(zhēng)ATP從而抑制JNK，呈劑量相關(guān)性地抑制c-Jun的磷酸化。 在活體動(dòng)物缺血再灌注過程中應(yīng)用JNK抑制劑阻斷凋亡的研究，多見于腦、腎等器官，而心臟的研究則多是對(duì)原代培養(yǎng)的心肌細(xì)胞以及缺血預(yù)適應(yīng)心肌的研究，且

5、JNK在其中的作用多有分歧，在活體動(dòng)物心肌缺血再灌注過程中應(yīng)用JNK抑制劑阻斷凋亡的研究，鮮有報(bào)道。本研究將明確在麻醉大鼠心肌缺血再灌注過程中，使用JNK特異性阻斷劑SP600125，觀察其對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的影響，SP600125是否能減輕細(xì)胞凋亡以及減少梗塞面積，對(duì)缺血再灌注過程中血流動(dòng)力學(xué)的是否影響，并試圖探討阻斷該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路減輕心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)理及可行性。 方法 一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) SD大鼠隨

6、機(jī)分成5組。(1)A組：假手術(shù)組；(2)B組：空白對(duì)照組；(3)C/D/E組：實(shí)驗(yàn)組，冠狀動(dòng)脈結(jié)扎后25min，即松開結(jié)扎前5分鐘，靜脈給予單劑量的SP600125分別為1.5、4.5和15mgkg-1，再灌注的3小時(shí)過程中，再持續(xù)應(yīng)用劑量分別為18、55和183μgkg-1min-1，即可維持相應(yīng)的血藥濃度分別為1、3和10μgml-1。 二、動(dòng)物模型 雄性成年SD大鼠，戊巴比妥腹腔注射麻醉，人工呼吸機(jī)支持呼吸，開胸后

7、在左冠脈的左前降支(LAD)起始部0.2-0.3cm處，用7*0縫合線穿一結(jié)扎線，收緊結(jié)扎線以造成缺血。心肌缺血時(shí)心肌局部顏色變暗、活動(dòng)減弱、平均動(dòng)脈壓(MBP)下降、心電圖QRS波突然增高、增寬、ST-T上升。30min后，松開結(jié)扎線形成再灌注，心電圖QRS波振幅回落，再灌注持續(xù)180min。心肌再灌注3小時(shí)，原位結(jié)扎LAD，從右頸動(dòng)脈注入1％苔盼藍(lán)3mlkg-1，使之灌注藍(lán)染非缺血區(qū)心肌。隨即取下整個(gè)心臟，以磷酸緩沖液沖洗，剪去心房

8、。 三、心肌梗死范圍測(cè)定 動(dòng)物模型取下的心臟切成2mm厚的心肌片.以1％TTC染色，甲醛溶液固定、稱量，心肌片兩面掃描.對(duì)圖像進(jìn)行面積測(cè)定，比較心肌梗塞范圍、缺血危險(xiǎn)區(qū)范圍以及梗死范圍與缺血危險(xiǎn)區(qū)范圍之比(infarctsize/riskarea)。 四、血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) 實(shí)驗(yàn)大鼠麻醉、氣管切開接人工呼吸機(jī)后，分離左、右頸總動(dòng)脈，左、右頸總動(dòng)脈各插入一條含PE管，連接壓力換能器，分別將信號(hào)輸入到生物信號(hào)采集

9、處理系統(tǒng)，以監(jiān)測(cè)大鼠血壓和左心室血流動(dòng)力學(xué)變化。觀察指標(biāo)包括收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MBP)。左心室收縮壓(LVSP)、左心室等容期壓力最大變化速率(±dp/dtmax)、左心室舒張壓(LVDP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、心率(HR)。左心室發(fā)展壓(LVDP')系LVSP與LVDP的差值。用藥前、缺血期及再灌注期每隔15min記錄一次上述指標(biāo)。 五、心肌末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記

10、(TUNEL) 大鼠缺血30min，再灌注180min手術(shù)結(jié)束時(shí)，動(dòng)脈模型取下的心臟以磷酸緩沖液(PBS，pH7.4)沖洗，剪去心房，保留冠狀動(dòng)脈結(jié)扎位點(diǎn)以下的心室部分，垂直于心室長(zhǎng)軸橫切成4-6塊1-2mm厚的心肌片，第三片常規(guī)石臘固定，用于凋亡細(xì)胞的TUNEL分析。觀察已染色的切片，TUNEL陽(yáng)性核為蘭紫到黑色，陰性核紅色。觀察整張切片后，每片切片選7個(gè)觀察點(diǎn)，每個(gè)觀察點(diǎn)取0.073mm2心肌組織，計(jì)位于心肌細(xì)胞內(nèi)的TUNE

11、L陽(yáng)性核數(shù)量，7個(gè)點(diǎn)總和代表整個(gè)心臟橫切面心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性情況。 六、DNA瓊脂糖凝膠電泳 垂直于心室長(zhǎng)軸橫切成4-6塊1-2mm厚的心肌片，自心底至心尖依次定為A片、B片、C片、D片、E片和F片，第二片液氮冰凍用于DNA提取，然后做DNA電泳。取100mg組織塊于液氮中研成粉末，DNA抽提，于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳，紫外成像。 結(jié)果 一、SP600125對(duì)缺血再灌注心肌梗塞范圍的影響 結(jié)

12、扎LAD造成心肌缺血危險(xiǎn)區(qū)(riskarea)的范圍基本一致，組B、組C、組D和組E分別為42.17±2.17％、43.17±3.83％、45.83±4.17％和41.50±4.5％，各組間無(wú)顯著性差異。缺血30min再灌注180min造成心肌梗塞范圍(infarctsize，IS)組B、組C、組D和組E分別為32.33±4.33％、23.83±3.17％、18.17±3.82％和18.17±3.17％，組C、組D和組E的IS有所下降，

13、但統(tǒng)計(jì)無(wú)顯著性差異。能較好反映心肌損傷的Infarct/risk指標(biāo)組B、組C、組D和組E分別為76.92±4.90％、54.78±3.00％、39.47±3.76％和43.76±4.96％，組C較組B下降22％，組D較組B下降37％，組E較組B下降33％，組D和組E對(duì)比組B有顯著性差異(p＜0.001)，組D和組E間Infarct/risk指標(biāo)無(wú)顯著差異(P=0.92)。如此說明SP600125使缺血再灌注心肌損傷減輕，縮小梗塞面積，

14、并存在一定的量效關(guān)系，并且在較大劑量時(shí)(4.5mgkg-1+55μgkg-1min-1，15mgkg-1+183μgkg-1min-1)能發(fā)揮較好的保護(hù)作用，但其發(fā)揮的最大效應(yīng)似乎來(lái)自D組，再增加劑量的E組未再進(jìn)一步縮小梗塞面積。 二、血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)結(jié)果 對(duì)+dp/dtmax、LVDP'、LVSP指標(biāo)監(jiān)測(cè)結(jié)果提示SP600125有改善心肌缺血復(fù)灌后大鼠心臟收縮功能，且有一定的量效關(guān)系；而缺血期各組LVEDP值均高于A組對(duì)

15、應(yīng)值，但給藥組與B組間無(wú)顯著性差異。再灌注期LVEDP值，各組與A組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。缺血再灌注期SP600125各劑量組-dp/dtmax值明顯高于B組。提示經(jīng)三種劑量方式給予SP600125預(yù)處理可改善大鼠心肌缺血復(fù)灌后心室舒張功能損傷；SP600125預(yù)處理對(duì)大鼠血壓和心率幾乎沒有影響。 三、心肌細(xì)胞凋亡結(jié)果 SP600125減少了缺血再灌注缺血區(qū)心肌細(xì)胞TUNEL陽(yáng)性核；所有缺血危險(xiǎn)區(qū)心肌DNA瓊脂糖凝膠電泳都顯

16、示了繃胞凋亡特征性的梯狀(“l(fā)adder”)現(xiàn)象。非缺血區(qū)DNA瓊脂糖凝膠電泳有隱約可見的“l(fā)adder”條帶。 結(jié)論 一、SP600125可明顯減少麻醉大鼠冠脈缺血再灌注的心梗面積，減少心梗面積的作用存在一定的量效關(guān)系，只有中等劑量組(D組)和高劑量組(E)組，與對(duì)照組存在顯著差異，而出現(xiàn)保護(hù)作用的高峰似乎來(lái)自D組的給藥方案，再增加劑量后，保護(hù)作用未再增強(qiáng)。 二、雖然減少了梗塞面積，但并未明顯影響血流動(dòng)力學(xué)，似

17、乎只是抑制了缺血再灌注引起的凋亡。 三、本項(xiàng)研究TUNEL和DNA梯度的結(jié)果中，30分鐘的缺血及180分鐘的再灌注產(chǎn)生高表達(dá)的凋亡。SP600125干預(yù)后，此激活過程被明顯抑制。結(jié)果顯示通過抑制JNK活性，從而降低鏈級(jí)發(fā)生的凋亡反應(yīng)，可改善缺血后心臟功能。 總之，JNK抑制劑在心肌缺血再灌注中抗凋亡和恢復(fù)心功能的積極作用，對(duì)今后的臨床藥物的開發(fā)提供了重要指引，可能預(yù)示著對(duì)缺血性心臟病新的治療策略，將來(lái)還需進(jìn)一步確定JNK