機(jī)械應(yīng)力影響鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞OPG-RANKLmRNA表達(dá)變化的研究.pdf

1、骨吸收刺激因素包括機(jī)械刺激、細(xì)胞因子和生長因子刺激等.目前普遍認(rèn)為,骨吸收刺激因素對前體破骨細(xì)胞的誘導(dǎo)功能并不是直接作用于破骨細(xì)胞本身,而是通過作用于骨髓基質(zhì)細(xì)胞,引起骨髓基質(zhì)細(xì)胞表型改變,產(chǎn)生旁分泌作用于鄰近的單核前體破骨細(xì)胞,使其進(jìn)一步分化、融合成多核破骨細(xì)胞.骨髓基質(zhì)細(xì)胞與前體破骨細(xì)胞的作用是體內(nèi)破骨細(xì)胞形成、分化的必需條件.其中,骨髓基質(zhì)細(xì)胞合成、分泌的兩種因子在促進(jìn)破骨細(xì)胞生成過程中起著關(guān)鍵性的作用,轉(zhuǎn)錄因子NF-κB受體活化

2、劑配體(receptor activator of NF-KBligand,RANKL)和另一種由成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌的可溶性細(xì)胞因子骨保護(hù)素(Osteoprotegerin OPG).RANKL又稱破骨細(xì)胞分化因子(osteoclastdifferentiation factor,ODF),是一種調(diào)節(jié)骨代謝的重要因子,主要表達(dá)在成骨細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞以及胸腺、淋巴結(jié)和脾組織中.RANKL能夠促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟和活化[1,2

3、].RANKL與破骨細(xì)胞前體上的腫瘤壞死因子超家族成員破骨細(xì)胞分化因子受體(ReceptorActivator of Nuclear Factor-κB RANK)膜蛋白結(jié)合,從而促進(jìn)破骨細(xì)胞前體的分化和成熟[3]而骨保護(hù)素(Osteoprotegerin OPG)能與RANKL競爭性結(jié)合RANK,阻止RANKL與RANK的結(jié)合.由此可見骨髓基質(zhì)細(xì)胞在破骨細(xì)胞分化中的重要作用[4]. 機(jī)械應(yīng)變是調(diào)控RANKL和OPG合成和分泌變

4、化的一種重要的刺激因素.骨髓基質(zhì)細(xì)胞是一種力學(xué)可興奮細(xì)胞,體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,一定范圍的機(jī)械力可以影響骨髓基質(zhì)細(xì)胞的RANKL和OPG的表達(dá),且表達(dá)的量與機(jī)械刺激的大小、頻率、作用時(shí)間緊密相聯(lián).機(jī)械張力在250-2000μe是可為骨組織的維持提供有效的生理性的刺激.當(dāng)張力超過2500 με時(shí),雖然仍可刺激刺激骨形成,但是在這樣的病理性負(fù)荷的作用下骨組織的破壞速度亦大大加快[5]. 研究目的: 1.本實(shí)驗(yàn)通過一種先進(jìn)的體外細(xì)

5、胞拉伸加力裝置,對鼠骨髓基質(zhì)原代細(xì)胞施加生理性及周期牽張力,觀察細(xì)胞受力前后細(xì)胞形態(tài)及增殖活性的變化. 2.對鼠骨髓基質(zhì)原代細(xì)胞分別施加生理性周期性牽張力,觀察RANKL.和OPG基因的表達(dá)變化. 材料和方法: 1.體外細(xì)胞加力裝置及力學(xué)刺激細(xì)胞加力采用華中電子科技大學(xué)研制的四點(diǎn)彎曲細(xì)胞力學(xué)加載儀.該裝置的原理是對彈性塑料板加力使之彎曲,從而使貼壁生長于板上的細(xì)胞受到相應(yīng)的機(jī)械牽張力.將大鼠原代骨髓細(xì)胞接種到特制

6、的塑料培養(yǎng)板上,繼續(xù)培養(yǎng)24h,培養(yǎng)板上的細(xì)胞生長到80﹪匯合,將培養(yǎng)板放入加力皿內(nèi),在加力裝置上進(jìn)行加力.細(xì)胞所受的張力大小由彈性板的彎曲位移(mm)表示,位移越大,形變越大,表示細(xì)胞受牽張力越大.本研究加力頻率為0.5Hz,位移為1.0mm,即張力為1785p的生理性應(yīng)力. 2.原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞取材骨髓取自清潔級重120g左右雄性SD大鼠.頸椎脫臼法處死2只大鼠,將其完全浸沒于75﹪酒精中,5分鐘后取出置于無菌冰浴手術(shù)臺上.

7、分離并取出大鼠后肢雙側(cè)股骨和脛骨,去凈附著的肌纖維,在超凈臺內(nèi)剪去兩端骨骺,用10ml針筒吸取完全培養(yǎng)基(含80﹪α-MEM,20﹪胎牛血清,100U/ml肝素),以不同方向沖洗骨髓腔共4次.細(xì)胞吹打均勻后接種于直徑60mm的塑料培養(yǎng)皿,在37℃、5﹪CO<,2>、飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng).整個(gè)過程要求嚴(yán)格無菌、操作迅速.半小時(shí)后吸取細(xì)胞混懸液,按1×10<'6>/ml接種至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中.每隔兩天換液,逐步換去其它參雜的懸浮細(xì)胞.一般7-9天

8、后細(xì)胞鋪滿底壁,以0.25﹪胰酶消化傳代,反復(fù)傳代法純化鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞,細(xì)胞傳至第三代時(shí)備用. 3.細(xì)胞加力 將接近融合的第三代骨髓基質(zhì)細(xì)胞按1×10<'8>/ml的密度接種在2x5cm<'2>的塑料培養(yǎng)板上,分成六組.24h后細(xì)胞接近匯合時(shí)將細(xì)胞培養(yǎng)板置入四點(diǎn)彎曲細(xì)胞加力裝置中.設(shè)置位移為1mm,頻率為0.5 hz的機(jī)械張應(yīng)力.6組的加力時(shí)間分別為O h、1 h、3 h、6 h、9 h、12 h.整個(gè)加力過程在無菌的加

9、力皿中進(jìn)行,加力裝置放置在細(xì)胞培養(yǎng)箱中. 4.RT-PCR檢測機(jī)械力刺激下細(xì)胞RANKL、OPGmRNA的量的變化細(xì)胞在特制的培養(yǎng)板上生長到對數(shù)生長期時(shí),加力位移1.0 mm,頻率0.5Hz、加力時(shí)間12 h.加力過程中,分別在Oh、1h、3h、6h、9h、12h這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集加力后的細(xì)胞進(jìn)行檢測.各組平行重復(fù)3次,數(shù)據(jù)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析. 結(jié)果: 1.原代鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞:生長緩慢,大約培養(yǎng)7～9天后,細(xì)胞逐漸融合.

10、細(xì)胞形態(tài)為紡錘形或成纖維樣細(xì)胞,單核,核圓形或卵圓形,有集落樣生長趨勢.原代骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)多次傳代,混雜的血細(xì)胞減少,細(xì)胞類型趨向一致,排列更有序,呈現(xiàn)更活躍的增殖活動(dòng). 2.RANKLmRAN隨加力時(shí)間變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果:顯示自6h開始RANKLmRNA開始減少(34.4﹪),但6 h、9 h、12 h之間沒有顯著差異.OPGmRAN隨加力時(shí)間變化統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示自9 h開始OPGmRAN開始增加(73﹪),但9 h、12 h之間沒有顯