新城疫病毒通過PKR-PERK和GADD34-PP1調(diào)控eIF2α的磷酸化和翻譯起始效率的研究.pdf

1、新城疫（Newcastle disease, ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）引起的，在家禽和野生鳥類廣泛傳播的疾病。NDV屬于副粘病毒科（Paramyxovirinae）、禽腮腺炎病毒屬（Avulavirus），為單股負(fù)鏈、不分節(jié)段的RNA病毒。
　　真核翻譯起始因子2α（Eukaryotic Initiation Factor2α, eIF2α）Ser51位點(diǎn)磷酸化抑制蛋白翻譯起

2、始，是細(xì)胞應(yīng)對各種應(yīng)激采取的保護(hù)策略。例如，細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白積累，病毒感染，氨基酸饑餓等。宿主細(xì)胞內(nèi)有四種能引起 eIF2α磷酸化的激酶：PKR（ double-stranded RNA-dependent protein kinase）， PERK（ PKR-like ER kinase）， GCN(general control non-derepressible-2)，HRI(heme-regulated inhibito

3、r)。
　　RNA病毒感染細(xì)胞，促使干擾素分泌增加，誘導(dǎo)PKR上調(diào)表達(dá)。病毒增值產(chǎn)生的dsRNA激活PKR，進(jìn)而磷酸化eIF2α，導(dǎo)致蛋白翻譯關(guān)閉。大量未折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，GRP78（78 kDa glucose-regulated protein）從PERK解離，PERK發(fā)生二聚化并自我磷酸化?；罨腜ERK磷酸化eIF2α，導(dǎo)致蛋白翻譯關(guān)閉，進(jìn)而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力。eIF2α的磷酸化卻能促進(jìn)激活轉(zhuǎn)錄因子 ATF4（activ

4、ating transcription factor4）mRNA翻譯，進(jìn)而增強(qiáng) GADD34(growth arrest and DNA damage-inducible protein34)表達(dá)。
　　蛋白磷酸酶1（Protein phosphatase1, PP1）是真核生物主要的絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶，通過催化亞基 PP1c與不同調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，形成復(fù)合體，執(zhí)行多種多樣的生物學(xué)功能。其中一個(gè)重要調(diào)節(jié)亞基是GADD34，eIF2α

5、磷酸化時(shí)上調(diào)表達(dá)，幫助PP1去磷酸化eIF2α，從而恢復(fù)蛋白翻譯。
　　病毒感染通常引起細(xì)胞壓力應(yīng)激，并通過磷酸化eIF2α介導(dǎo)感染細(xì)胞的蛋白翻譯關(guān)閉。NDV感染能引起家禽快速死亡，并能選擇性殺死人的癌細(xì)胞，其具體分子機(jī)制尚未清楚。
　　本項(xiàng)目著重于研究 NDV調(diào)控主細(xì)胞蛋白翻譯系統(tǒng)的分子機(jī)制。嘌呤霉素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)表明，在 NDV感染前期（0-12小時(shí)），人子宮頸癌細(xì)胞（HeLa）和雞成纖維細(xì)胞（DF-1）蛋白翻譯維持在活躍狀態(tài)

6、，而在感染后期（12-24小時(shí)）蛋白翻譯效率逐漸降低。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，eIF2αSer51位點(diǎn)的磷酸化抑制了蛋白翻譯起始，從而降低蛋白翻譯效率。Western Blotting實(shí)驗(yàn)分析表明，在病毒感染12小時(shí)后，eIF2α激酶PKR的表達(dá)量上升，并被磷酸化激活；位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的eIF2α激酶PERK被磷酸化，并被剪切成兩個(gè)片段。藥物抑制實(shí)驗(yàn)證明：抑制PKR的活性阻止了eIF2α的磷酸化，而抑制PERK活性對eIF2α的磷酸化沒有影響，說

7、明PKR識別病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA），介導(dǎo)了 eIF2α的磷酸化和抑制蛋白翻譯關(guān)閉。另外，eIF2α高磷酸化水平導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4被優(yōu)先翻譯，進(jìn)而上調(diào)表達(dá)eIF2α磷酸酶PP1的調(diào)節(jié)亞基GADD34。GADD34能夠與PP1結(jié)合，水解eIF2αSer51位點(diǎn)的磷酸基團(tuán)。通過外源表達(dá)GADD34，我們證實(shí)了GADD34能夠降低eIF2α的磷酸化水平，并部分恢復(fù)蛋白翻譯效率，并有利于病毒蛋白的合成。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在N