HMGB1在骨肉瘤對(duì)化療藥物耐藥中所起的作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的:骨肉瘤是兒童和青少年長(zhǎng)骨上最常見(jiàn)的惡性腫瘤，在對(duì)這種腫瘤的治療中，人們發(fā)現(xiàn)其常常會(huì)對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，并最終導(dǎo)致治療失敗，但其耐藥的具體分子機(jī)制尚不清楚。我們所研究的HMGB1是一種核內(nèi)DNA結(jié)合蛋白，在許多細(xì)胞內(nèi)都有表達(dá)，作為DNA的結(jié)合蛋白，HMGB1參與了DNA的復(fù)制、重組和轉(zhuǎn)錄，其分泌形式又可發(fā)揮細(xì)胞因子樣作用，在骨肉瘤耐藥性形成過(guò)程中HMGB1就是以分泌形式發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的。本課題初步研究HMGB1在骨肉瘤對(duì)化療藥物耐

2、藥中所起的作用和機(jī)制。
　　 方法:在體外的細(xì)胞水平研究中，我們通過(guò)使用阿霉素、順鉑和氨甲喋呤等抗腫瘤化療藥物作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63、SaOS-2和U-2OS后，采用Western blotting，TUNEL，免疫共沉淀，RNAi介導(dǎo)敲除，cDNA轉(zhuǎn)染，免疫熒光顯像分析，流式細(xì)胞技術(shù)，電鏡等檢測(cè)技術(shù)和手段分析HMGB1的表達(dá)以及其與自噬和骨肉瘤耐藥的作用。
　　 結(jié)果:在體外的細(xì)胞水平研究中，我們通過(guò)使用阿霉素、順

3、鉑和氨甲喋呤等抗腫瘤化療藥物作用于骨肉瘤細(xì)胞MG-63、SaOS-2和U-2OS后，發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)HMGB1顯著上調(diào)，并具有時(shí)間依賴性。而采用RNAi介導(dǎo)方式敲除HMGB1后可以觀察到恢復(fù)了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。而用HMGB1cDNA轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞促進(jìn)其過(guò)度表達(dá)HMGB1后，可以觀察到骨肉瘤細(xì)胞對(duì)順鉑、阿霉素和氨甲喋呤耐藥增強(qiáng)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，HMGB1的過(guò)度表達(dá)增加了LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)化，LC3已知被廣泛應(yīng)用于

4、檢測(cè)自噬。敲除 PI3KC3、Beclin1和Atg7等自噬調(diào)節(jié)因子后，改變了HMGB1所誘導(dǎo)的抗化療作用，這一作用減少了自噬增加了凋亡。通過(guò)免疫印跡分析和免疫熒光顯像分析后發(fā)現(xiàn)，敲除HMGB1抑制了化療所誘導(dǎo)的LC3Ⅱ的表達(dá)，而且通過(guò)LC3抗體或者mRFP-GFP-LC3結(jié)構(gòu)抑制LC3后可以明顯減少LC3在細(xì)胞內(nèi)的聚集，在進(jìn)一步評(píng)估了p62的表達(dá)后發(fā)現(xiàn)HMGB1的敲除也減少了p62自噬降解數(shù)量。這一系列實(shí)驗(yàn)支持HMGB1在骨肉瘤細(xì)胞調(diào)

5、節(jié)自噬中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。隨后的研究中我們還發(fā)現(xiàn)，由于雷帕霉素可以誘發(fā)自噬，而HMGB1的敲除明顯減少了雷帕霉素所引起的細(xì)胞自噬，雷帕霉素對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用也隨之減少，這再一次說(shuō)明HMGB1在自噬調(diào)節(jié)的細(xì)胞存活中也發(fā)揮重要作用。為了研究HMGB1調(diào)節(jié)自噬的潛在機(jī)制，我們通過(guò)免疫印跡分析和免疫沉淀分析等實(shí)驗(yàn)手段，分別檢測(cè)了骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)ULK1、mAtg13、FIP200、Beclin1和PI3KC3等蛋白表達(dá)情況，證實(shí)在骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)HMGB1

6、和Beclin1可以形成復(fù)合體，敲除ULK1和FIP200的蛋白表達(dá)后抑制了HMGB1和Beclin1之間的相互作用。這說(shuō)明HMGB1可以結(jié)合自噬調(diào)節(jié)子Beclin1并通過(guò)調(diào)節(jié)Beclin1-PI3KC3復(fù)合物的形成來(lái)促進(jìn)自噬進(jìn)行。而HMGB1和Beclin1之間的復(fù)合物的形成還依賴自噬復(fù)合物ULK1-mAtg13-FIP200的參與。抑制自噬中的這些通路將增加化療藥物敏感性。在動(dòng)物體內(nèi)研究中，我們將MG-63腫瘤細(xì)胞接種到實(shí)驗(yàn)鼠背部，

7、用阿霉素進(jìn)行治療后發(fā)現(xiàn)，HMGB1敲除的腫瘤細(xì)胞接種鼠腫瘤大小較對(duì)照組明顯減小。同時(shí)檢測(cè)LC3發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組LC3分布減少，而用TUNEL檢測(cè)凋亡后發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組凋亡明顯增加。這說(shuō)明與對(duì)照組相比，HMGB1特異shRNA轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞在治療后減少了自噬并增加了凋亡。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，HMGB1在調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性方面有重要作用。綜上所述，HMGB1作為自噬調(diào)節(jié)子在化療藥物耐藥性的產(chǎn)生中發(fā)揮了重要作用，這一發(fā)現(xiàn)將為骨肉瘤治療提供新的研究

8、方向。
　　 結(jié)論:化療藥物阿霉素、順鉑和氨甲喋呤促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG-63，SAOS-2和U-2OS內(nèi)HMGB1表達(dá);在體外實(shí)驗(yàn)中抑制HMGB1增加了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的敏感性;體外實(shí)驗(yàn)中HMGB1的過(guò)量表達(dá)增加了骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療的耐藥性;動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制HMGB1表達(dá)恢復(fù)骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性;HMGB1調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞化療過(guò)程發(fā)生的自噬;在骨肉瘤細(xì)胞化療過(guò)程中HMGB1參與調(diào)節(jié)自噬中Beclin1-PI3KC3復(fù)合物的形成