HMGB1在骨肉瘤對化療藥物耐藥中所起的作用和機制研究.pdf

1、目的:骨肉瘤是兒童和青少年長骨上最常見的惡性腫瘤，在對這種腫瘤的治療中，人們發(fā)現其常常會對化療藥物產生耐藥，并最終導致治療失敗，但其耐藥的具體分子機制尚不清楚。我們所研究的HMGB1是一種核內DNA結合蛋白，在許多細胞內都有表達，作為DNA的結合蛋白，HMGB1參與了DNA的復制、重組和轉錄，其分泌形式又可發(fā)揮細胞因子樣作用，在骨肉瘤耐藥性形成過程中HMGB1就是以分泌形式發(fā)揮免疫調節(jié)作用的。本課題初步研究HMGB1在骨肉瘤對化療藥物耐

2、藥中所起的作用和機制。
　　 方法:在體外的細胞水平研究中，我們通過使用阿霉素、順鉑和氨甲喋呤等抗腫瘤化療藥物作用于骨肉瘤細胞MG-63、SaOS-2和U-2OS后，采用Western blotting，TUNEL，免疫共沉淀，RNAi介導敲除，cDNA轉染，免疫熒光顯像分析，流式細胞技術，電鏡等檢測技術和手段分析HMGB1的表達以及其與自噬和骨肉瘤耐藥的作用。
　　 結果:在體外的細胞水平研究中，我們通過使用阿霉素、順

3、鉑和氨甲喋呤等抗腫瘤化療藥物作用于骨肉瘤細胞MG-63、SaOS-2和U-2OS后，發(fā)現骨肉瘤細胞內HMGB1顯著上調，并具有時間依賴性。而采用RNAi介導方式敲除HMGB1后可以觀察到恢復了骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性。而用HMGB1cDNA轉染骨肉瘤細胞促進其過度表達HMGB1后，可以觀察到骨肉瘤細胞對順鉑、阿霉素和氨甲喋呤耐藥增強。在進一步的實驗中我們發(fā)現，HMGB1的過度表達增加了LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉化，LC3已知被廣泛應用于

4、檢測自噬。敲除 PI3KC3、Beclin1和Atg7等自噬調節(jié)因子后，改變了HMGB1所誘導的抗化療作用，這一作用減少了自噬增加了凋亡。通過免疫印跡分析和免疫熒光顯像分析后發(fā)現，敲除HMGB1抑制了化療所誘導的LC3Ⅱ的表達，而且通過LC3抗體或者mRFP-GFP-LC3結構抑制LC3后可以明顯減少LC3在細胞內的聚集，在進一步評估了p62的表達后發(fā)現HMGB1的敲除也減少了p62自噬降解數量。這一系列實驗支持HMGB1在骨肉瘤細胞調

5、節(jié)自噬中發(fā)揮了關鍵作用。隨后的研究中我們還發(fā)現，由于雷帕霉素可以誘發(fā)自噬，而HMGB1的敲除明顯減少了雷帕霉素所引起的細胞自噬，雷帕霉素對細胞的保護作用也隨之減少，這再一次說明HMGB1在自噬調節(jié)的細胞存活中也發(fā)揮重要作用。為了研究HMGB1調節(jié)自噬的潛在機制，我們通過免疫印跡分析和免疫沉淀分析等實驗手段，分別檢測了骨肉瘤細胞內ULK1、mAtg13、FIP200、Beclin1和PI3KC3等蛋白表達情況，證實在骨肉瘤細胞內HMGB1

6、和Beclin1可以形成復合體，敲除ULK1和FIP200的蛋白表達后抑制了HMGB1和Beclin1之間的相互作用。這說明HMGB1可以結合自噬調節(jié)子Beclin1并通過調節(jié)Beclin1-PI3KC3復合物的形成來促進自噬進行。而HMGB1和Beclin1之間的復合物的形成還依賴自噬復合物ULK1-mAtg13-FIP200的參與。抑制自噬中的這些通路將增加化療藥物敏感性。在動物體內研究中，我們將MG-63腫瘤細胞接種到實驗鼠背部，

7、用阿霉素進行治療后發(fā)現，HMGB1敲除的腫瘤細胞接種鼠腫瘤大小較對照組明顯減小。同時檢測LC3發(fā)現實驗組LC3分布減少，而用TUNEL檢測凋亡后發(fā)現實驗組凋亡明顯增加。這說明與對照組相比，HMGB1特異shRNA轉染的腫瘤細胞在治療后減少了自噬并增加了凋亡。動物體內實驗進一步證實，HMGB1在調節(jié)骨肉瘤細胞的耐藥性方面有重要作用。綜上所述，HMGB1作為自噬調節(jié)子在化療藥物耐藥性的產生中發(fā)揮了重要作用，這一發(fā)現將為骨肉瘤治療提供新的研究

8、方向。
　　 結論:化療藥物阿霉素、順鉑和氨甲喋呤促進骨肉瘤細胞MG-63，SAOS-2和U-2OS內HMGB1表達;在體外實驗中抑制HMGB1增加了骨肉瘤細胞對化療的敏感性;體外實驗中HMGB1的過量表達增加了骨肉瘤細胞對化療的耐藥性;動物實驗證實抑制HMGB1表達恢復骨肉瘤細胞對化療藥物的敏感性;HMGB1調節(jié)骨肉瘤細胞化療過程發(fā)生的自噬;在骨肉瘤細胞化療過程中HMGB1參與調節(jié)自噬中Beclin1-PI3KC3復合物的形成