5-脂氧酶在腦缺血損傷后的腦內(nèi)表達及其功能調(diào)節(jié)特點.pdf

1、5-脂氧酶(5-Lipoxygenase,5-LOX,EC 1.13.11.34)是催化花生四烯酸代謝成白三烯的關(guān)鍵酶.白三烯包括白三烯B<,4>(LTB<,4>)以及半胱氨酰白三烯類(cysteinyl leuKotrienes,CysLlTS,包括LTC<,4>,LTD<,4>,LTE<,4>),是體內(nèi)一類重要的炎癥介質(zhì),介導(dǎo)平滑肌痙攣、微血管滲漏等反應(yīng),參與多種炎癥性疾病的病理過程.5-LOX最早發(fā)現(xiàn)于外周組織,因而,早期對其病理

2、意義的研究亦主要集中在哮喘、過敏性鼻炎等外周疾病.近幾年的研究發(fā)現(xiàn),5-LOX在中樞神經(jīng)系統(tǒng)也有表達,參與腦缺血、腦外傷、腦腫瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病變過程.腦缺血后,腦內(nèi)5-LOX表達增加,其活性代謝產(chǎn)物自三烯亦顯著增多;5-LOX抑制劑,如AA861、MK-886和去甲二氫愈創(chuàng)木脂酸(nordihydroguaiaretic acid,NDGA),對缺血性腦損傷具有保護作用.近來又有文獻報道編碼5-LOX激活蛋白(5-lipoxyg

3、enase actiVating protein,FLAP)的基因(ALOX5AP)可增加腦卒中的危險性.然而,另有研究發(fā)現(xiàn),5-LOX基因敲除小鼠腦缺血后腦梗塞體積同野生型小鼠相比,沒有明顯差別.這種矛盾現(xiàn)象表明5-LOX功能的復(fù)雜性,其在腦缺血損傷中的作用需要進一步研究. 另一方面,腦缺血是一個高度復(fù)雜的病理生理過程,可分成三個連續(xù)的過程:一是能量代謝障礙和興奮性氨基酸毒性(急性期,幾分鐘到幾小時);二是炎癥和凋亡(亞急性期,幾小時

4、到幾天);三是修復(fù)和再生(慢性期,幾天到幾個月).腦缺血急性期和亞急性期的主要損傷特點,是神經(jīng)元的凋亡和壞死;而腦缺血慢性期變化的特點,是反應(yīng)性膠質(zhì)細胞增生及膠質(zhì)疤痕的形成.5-LOX如何調(diào)節(jié)在腦缺血急性、亞急性期及慢性期中的功能變化,仍不清楚,需要進一步研究. 為了進一步闡明5-LOX在腦缺血損傷中的作用,本實驗首先在大鼠大腦中動脈栓塞(middle cerebral ischemia occlusion,MCAO)誘導(dǎo)的腦缺

5、血模型上,觀察腦缺血后14天內(nèi)5-LOX表達和酶活性的時間和空間變化特點.我們將再灌注后3～24小時定義為損傷早期(包括急性期和亞急性期),再灌注后3～14天定義為損傷后期(包括亞急性期和慢性期).然后,應(yīng)用5-LOX抑制劑咖啡酸,分別研究了5-LOX與腦缺血后神經(jīng)元損傷以及星形膠質(zhì)細胞增生的關(guān)系;并在大鼠MCAO誘導(dǎo)的在體腦缺血模型及細胞缺糖缺氧(oxygen-glucose deprivationOGD)誘導(dǎo)的體外腦缺血模型上,進一

6、步應(yīng)用5-LOX抑制劑,觀察5-LOX在腦缺血中的功能變化特點. 第一部分 5-LOX在大鼠局灶性腦缺血后腦內(nèi)表達及酶活性的時空變化特點 目的:觀察腦缺血后5-LOX在腦內(nèi)表達及酶活性的時空變化特點. 方法:MCAO 30分鐘誘導(dǎo)大鼠局灶性腦缺血模型,觀察腦缺血后14天內(nèi)腦損傷的變化特征;同時應(yīng)用RT-PCR、Western blot方法,觀察腦缺血后5-LOX在腦內(nèi)表達變化的時空特點;應(yīng)用免疫組織化學(xué)及免疫熒光

7、雙標染色的方法,觀察5-LOX在腦內(nèi)的分布變化特點;應(yīng)用酶聯(lián)免疫法,測定腦缺血后5-LOX活性代謝產(chǎn)物白三烯B4(LTB4)以及半胱氨酰白三烯(CysLTs)在腦內(nèi)的含量. 結(jié)果:(1)RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示,在腦缺血中心區(qū),再灌注12及24小時,5-LOX蛋白表達明顯增高;24小時達峰值;然后降低,7到14天后回到基線水平.在損傷的周邊區(qū),5-LOX在再灌注3天內(nèi)表達沒有明顯的改變,在再灌注7天明顯增加

8、并達峰值.(2)免疫組織化學(xué)和免疫熒光雙標染色的結(jié)果顯示,在缺血中心區(qū),5-LOX免疫陽性細胞在再灌注12小時至3天明顯升高,其中在再灌注24小時達峰值,主要表達在神經(jīng)元.在缺血周邊區(qū),5-LOX免疫陽性細胞在再灌注24小時沒有明顯增多,在再灌注后3到14天開始逐漸增多,且主要表達在增生的星形膠質(zhì)細胞.(3)5-LOX代謝產(chǎn)物自三烯的測定結(jié)果顯示,在缺血側(cè)皮層,再灌注后3小時CysLTs 的水平明顯升高,約為基線水平的15倍,并于再灌注

9、后6小時至24小時持續(xù)維持此高水平,再灌注3天后恢復(fù)到基線水平,再灌注7天后再次升高,14天后又降低.另一方面,缺血側(cè)皮層LTB<,4>的水平在再灌注3小時輕微升高,但在再灌注后7至14天則明顯升高. 結(jié)論:(1)腦缺血后5-LOX mRNA及蛋白的表達明顯上調(diào),并且在時空分布特點上,表現(xiàn)為在腦缺血早期主要表達在缺血中心區(qū)的神經(jīng)元,而在腦缺血后期主要表達在缺血周邊增生的星形膠質(zhì)細胞上.(2)5-LOX的活性代謝產(chǎn)物自三烯在缺血后

10、腦組織內(nèi)的含量變化呈雙峰狀,第一次高峰在腦缺血后3小時,CysLTs升高明顯;第二次高峰在腦缺血后7天,LTB<,4>升高顯著. 第二部分 5-LoX在缺血性神經(jīng)元損傷中的作用 目的:在第一部分,觀察到腦缺血再灌注24小時后,5-LOX 主要表達于缺血中心的神經(jīng)元.為了進一步闡明 5-LOX 對腦缺血早期神經(jīng)元損傷的調(diào)節(jié)作用,本部分應(yīng)用5-LOX抑制劑,觀察其對腦缺血早期缺血性神經(jīng)元損傷以及PC12細胞(神經(jīng)元樣細胞)缺

11、血樣損傷的作用. 方法:以MCAO 30分鐘,再灌注24小時建立大鼠局灶性腦缺血模型.在大鼠腦缺血前30分鐘、再灌同時、再灌后1、2小時,腹腔注射5-LOX抑制劑咖啡酸10、50 mg/kg,觀察5-LOX抑制劑咖啡酸對腦缺血早期損傷的作用,特別是其對神經(jīng)元損傷的作用.同時,在OGD 2小時,復(fù)灌24小時誘導(dǎo)的PC12細胞體外缺血模型上,用MTT法和 Hochest33258/PI染色法,進一步觀察5-LOX抑制劑咖啡酸及齊留通

12、對腦缺血損傷的作用. 結(jié)果:(1)整體實驗的結(jié)果表明,腦缺血30分鐘再灌注24小時后,大鼠神經(jīng)功能缺失明顯,損傷側(cè)腦組織水腫,神經(jīng)元死亡,梗死灶形成.咖啡酸(50mg/kg)可改善大鼠神經(jīng)功能缺失,保護缺血中心區(qū)的神經(jīng)元,減小腦梗死體積,減少腦缺血/再灌注后3小時腦內(nèi)5-LOX代謝產(chǎn)物CysLTs與LFB<,4>的生成.(2)離體實驗結(jié)果表明,OGD 2小時復(fù)灌24小時后,約有40﹪的PC12細胞凋亡,13﹪的細胞壞死.應(yīng)用 0

13、.01,0.1,μM咖啡酸處理后,PC12細胞的凋亡率減少到20﹪,且只有3﹪的細胞壞死.應(yīng)用0.1～100μM齊留通處理后,PCI2細胞的凋亡率減少到15﹪,壞死率降低到3﹪. 結(jié)論:5-LOX抑制劑咖啡酸能減輕腦缺血/再灌注后神經(jīng)元的損傷;5-LOX抑制劑咖啡酸和齊留通均可減輕缺糖缺氧誘導(dǎo)的PC12細胞缺血樣損傷.提示5-LOX參與了腦缺血早期缺血中心區(qū)神經(jīng)元的損傷. 第三部分 5-LOX在星形膠質(zhì)細胞增殖中的作用

14、 目的:在第一部分,觀察到腦缺血/再灌注后14天,5-LOX主要表達在缺血損傷周邊增生的星型膠質(zhì)細胞.為了進一步闡明5-LOX對腦缺血后期膠質(zhì)細胞增生的調(diào)節(jié)作用,本部分應(yīng)用5-LOX抑制劑,觀察其對腦缺血后期膠質(zhì)細胞增生的作用. 方法:以MCAO 30分鐘,再灌注14天建立大鼠局灶性腦缺血模型.在腦缺血再灌注后第一天分別在缺血前30分鐘、再灌同時、再灌后1、2小時,腹腔注射5-LOX抑制劑咖啡酸10、50 mg/kg,并在再

15、灌后第2到5天,每天腹腔注射兩次.觀察5-L,OX的抑制劑咖啡酸對大鼠腦缺血后期變化的作用,特別是其對損傷周邊區(qū)膠質(zhì)細胞增生的作用. 結(jié)果:腦缺血30分鐘/再灌注14天后,缺血側(cè)半球出現(xiàn)腦萎縮,并有明顯的梗死灶;在損傷周邊區(qū)的星形膠質(zhì)細胞明顯增多,且體積增大.5-LOX抑制劑咖啡酸(50.mg/kg)可減少腦梗死體積,減輕腦萎縮的程度,抑制損傷周邊區(qū)膠質(zhì)細胞的增生,減少腦缺血再灌注后7天腦內(nèi)5-LOX代謝產(chǎn)物CysLTs與LTB